Este artigo descreve a metodologia para determinar a resposta quimiotática de leucócitos para ligantes específicos e identificar as interações entre os receptores da superfície celular e as proteínas citosólicas usando técnicas de imagem de células vivas.
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Artigo de método
Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Receptores acoplados à proteína G (GPCRs) pertencem à família de proteínas transmembrana sete e mediar a transdução de sinais extracelulares de respostas intracelulares. GPCRs controle de diversas funções biológicas, como quimiotaxia, liberação de cálcio intracelular, regulação de genes de uma forma ligante dependente via heterotrimeric G-proteínas 1-2. Ligante de ligação induz uma série de mudanças conformacionais levando à ativação de heterotrimeric G-proteínas que modulam níveis de segundos mensageiros como a adenosina monofosfato cíclico (cAMP), o trifosfato de inositol (IP3) e glicerol diacyl (DG). Concomitante com a ativação da ligação ligante receptor também inicia uma série de eventos para atenuar o receptor de sinalização por meio de seqüestro de dessensibilização, e / ou internalização. O processo de dessensibilização dos GPCRs ocorre através de fosforilação do receptor de quinases da proteína G-receptor (GRKs) e subsequente ligação dos β-arrestinas 3. β-arrestinas são proteínas citosólicas e translocar para a membrana após a ativação GPCR, ligação aos receptores fosforilados (maioria dos casos) há, facilitando a internalização dos receptores 4-6.
Leucotrieno B 4 (LTB 4) é uma molécula de lipídio pró-inflamatórias derivadas de ácido araquidônico via e medeia suas ações através de GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1; um receptor de alta afinidade) e receptor LTB 4 2 (BLT2; um receptor de baixa afinidade ) 7-9. A LTB via 4-BLT1 foi mostrado para ser crítico em várias doenças inflamatórias, incluindo, artrite, asma e aterosclerose 10-17. O presente artigo descreve as metodologias desenvolvidas para monitorar LTB 4 induzida migração de leucócitos e as interações de BLT1 com β-arrestina e, a translocação do receptor em células vivas usando técnicas de microscopia de imagem 18-19.
Derivadas da medula óssea células dendríticas de camundongos C57BL / 6 foram isoladas e cultivadas como descrito anteriormente 20-21. Essas células foram testados em métodos de imagem ao vivo de células para demonstrar LTB 4 migração celular induzida. O BLT1 humano foi marcado com uma proteína fluorescente vermelha (BLT1-RFP) no C-terminal e β-arrestin1 marcados com proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) e os plasmídeos transfectados em ambos os Rat basofílico Leukomia (RBL-2H3) linhas celulares 18-19. A cinética de interação entre essas proteínas e localização foram monitorados através de microscopia de vídeo ao vivo da célula. As metodologias no presente trabalho descrevem o uso de técnicas microscópicas para investigar as respostas funcionais do G receptores acoplados à proteína em células vivas. O presente artigo também descreve o uso de Metamorph software para quantificar a intensidade de fluorescência para determinar a cinética do receptor e interações proteína citosólica.
Protocolo
Metodologia
Descrição do Microscópio
Experimentos com imagens ao vivo celular realizado TE-FM sistema Epi-Fluorescência anexado ao microscópio invertido Nikon Eclipse TE300. O microscópio equipado com estágio de aquecimento. A HQ digital de pressão fresca B / W CCD (Roper Scientific) câmera e LAMDA 02/10 óptico filtro changer (Sutter empresa instrumento) é anexado ao microscópio. Comprimentos de onda de excitação e emissão são controlados com rodas de filtros e controlado por controlador de roda Lamba 02/10 filtro, Sutter Instruments Co. tempo de exposição de 500 ms deve ser o suficiente para ver RFP ou GFP em célu....
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Discussão
Imagens de células vivas é uma poderosa ferramenta para demonstrar a função e interações de proteínas específicas à medida que ocorrem em tempo real. Os métodos descritos neste manuscrito mostram claramente que a LTB 4 pode induzir a migração rápida de células dendríticas. Estes métodos não só ampliar os aspectos da função LTB 4 a diversos tipos de células, eles permitem que métodos semelhantes para ser aplicado a uma variedade de quimiocinas e outros testes de sua eficácia como agentes quimiotátic.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
A pesquisa é suportada pelo National Institutes of Health bolsas AI-52381, CA138623 e Lung Cancer Research Board Kentucky e apoio institucional de James Graham Brown Cancer Center.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linhagem celular de leucemia basofílica de rato (RBL-2H3) ou células HEK293. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modificado de Eagle’meio mínimo essencial modificado de Dulbecco (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI ou DMEM sem vermelho de fenol | Invitrogen | 11835-030 | |
| Soro bovino fetal | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicilina-estreptomicina (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4Na, líquido | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen | 15630 | |
| Placas Fluoro com fundo de lamínula de vidro estéril de 35 mm (0,17 mm de espessura) (WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Cubeta estéril para Gene Pulser (entreferramenta de 0,4 cm) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II eletroporador | Bio-Rad | ||
| Sistema TE-FM de epifluorescência acoplado ao Microscópio Invertido Nikon Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Software Metamorph | Imagem Universal | ||
| Puxador microscópico vertical de micropipetas | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Micromanipulador Hidráulico MO-188NE | Narishige International | ||
| Manipulador Manual Grosso, MN-188NE | Narishige International | ||
| Construtos de cDNA: | |||
| cDNA do receptor acoplado à proteína G marcado com proteína fluorescente vermelha na extremidade C-terminal (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | ||
| cDNA da proteína citosólica marcada com GFP (β-arrestina1-GFP no presente estudo). | Jala et al 2005 |
Referências
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved i....
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Reimpressões e permissões
