Esta é uma demonstração de como membranas biológicas podem ser compreendidos através de modelos elétricos. Nós também demonstramos os procedimentos para registrar potenciais de ação a partir do cordão nervoso ventral do crustáceo para laboratórios de estudantes orientados.
Artigo de método
Modelagem de Membranas Biológicas, com placas de circuito e medição de sinais elétricos em Axônios: Exercícios Laboratório Student
Neste artigo
Resumo
Resumo
Esta é uma demonstração de como os modelos elétricos podem ser usadas para caracterizar membranas biológicas. Este exercício também apresenta a terminologia utilizada biofísicos em eletrofisiologia. O mesmo equipamento é utilizado no modelo de membrana como sobre os preparativos ao vivo. Algumas propriedades de um cordão nervoso isoladas são investigadas: potenciais de ação do nervo, o recrutamento de neurônios, e capacidade de resposta do cordão nervoso a fatores ambientais.
Protocolo
1. INTRODUÇÃO
1.1) Fundamentação
O conhecimento fundamental de circuitos elétricos é uma ferramenta valiosa para compreender e conceituar muitos aspectos da experimentação e teoria fisiológicas. Este exercício tem como objetivo familiarizá-lo com alguns princípios gerais envolvendo fontes de tensão, resistência elétrica e capacitância elétrica. Esses conceitos introdutórios fornecem a base para entender fenômenos como a transmissão sináptica e a propagação de sinais elétricos ao longo de uma fibra nervosa.
Uma palavra de cautela: em circuitos elétricos comuns compostos por fios metálicos e resistores, a CORRENTE é transportada por elétrons, que possuem carga negativa. Em sistemas biológicos, a corrente é transportada por ÍONS, que podem ter uma ou mais cargas positivas ou negativas. Por convenção, a corrente flui do positivo para o negativo (embora, é claro, os elétrons se movam na direção oposta).
Os componentes do circuito representam as propriedades elétricas de tecidos vivos e, em alguns casos, de objetos inanimados (como eletrodos) envolvidos em seu estudo.
Ao realizar o exercício, anote os resultados e os cálculos.
1.2) Princípios Gerais
As propriedades básicas de circuitos elétricos nos quais flui corrente contínua são descritas pela Lei de Ohm
V = IR
Onde V = tensão em volts (V)
I = corrente em ampères (A)
R = resistência em ohms (Ω)
Esta lei rege os potenciais que são observados em células nervosas com eletrodos. Primeiro, demonstraremos a Lei de Ohm e sua aplicação em materiais biológicos.
1.3) Materiais
| Item | Quantidade |
| Placa de prototipagem | 1 |
| Resistores: 330 K Ω | 1 |
| : 100 K Ω | 12 |
| : 33 K Ω | 6 |
| : 22 K Ω | 1 |
| : 10 K Ω | 6 |
| : 4.7 K Ω | 1 |
| : 2.2 K Ω | 1 |
| : 1.5 K Ω | 1 |
| : 1 K Ω | 1 |
| : 510 Ω | 1 |
| : 330 Ω | 1 |
| : 220 Ω | 1 |
| : 150 Ω | 1 |
| : 100 Ω | 1 |
| Capacitores: 0.1 μF | 6 |
| : 10 μF | 6 |
| Fios | 12 |
| PowerLab | 1 |
| Conectores de Saída do PowerLab | 1 |
| Conectores de Entrada do PowerLab | 1 |
| Volímetro (com capacidade de corrente) | 1 |
Chave de Codificação de Resistores
| Cor | Dígito |
| Preto | 0 |
| Marrom | 1 |
| Vermelho | 2 |
| Laranja | 3 |
| Amarelo | 4 |
| Verde | 5 |
| Azul | 6 |
| Violeta | 7 |
| Cinza | 8 |
| Branco | 9 |
| Prata | Tolerância de 10% |
| Dourado | Tolerância de 5% |
1ª Faixa - 1º Dígito
2ª Faixa - 2º Dígito
3ª Faixa - Número de Zeros
4ª Faixa - Tolerância
Figura 1: Configuração do Sistema. Computador, placa de prototipagem e laboratório de alimentação com estimulador de saída.
O sistema PowerLab (interface PowerLab da AD Instruments, Austrália) funcionará como fonte de tensão neste experimento. Conecte o cabo USB do PowerLab ao computador, ligue o PowerLab e abra o programa LabChart a partir da área de trabalho. Selecione "Novo Arquivo". Uma janela aparecerá com múltiplos canais de gravação. Selecione "Configuração" na parte superior e clique em "Configurações do Canal". No canto inferior esquerdo da janela, reduza o Número de Canais para 1; no Canal 1, altere a Faixa para 5 V. Conecte o cabo do estimulador com os dois conectores em gancho aos portais de Saída do PowerLab: conecte o cabo vermelho ao portal de Saída positivo e o cabo preto ao portal de Saída negativo. Em seguida, é necessário alterar a saída de potência, a frequência e a duração do pulso do PowerLab. Para isso, selecione "Configuração" e depois "Painel do Estimulador". Pulso longos de 1,5 V são necessários para a primeira parte do experimento; portanto, ajuste a amplitude para 0,75 V; isso fornecerá uma faixa de 1,5 V (o PowerLab emitirá uma tensão oscilando entre +0,75 V e -0,75 V). Defina a frequência (0,5 Hz) e a duração do pulso (1 s).
Figura 2: Esquemas da matriz de prototipagem. As faixas coloridas ao longo das laterais estão todas conectadas como uma unidade para cada cor. As 2 colunas horizontais no centro estão conectadas em cada metade, para uma determinada linha, mas não se cruzam na linha média nem se conectam às faixas laterais. Cada linha no centro é independente da próxima linha.
Ao usar uma matriz de contatos, existem duas colunas em cada lado utilizadas para os terminais de entrada e saída. O polo positivo geralmente é conectado à coluna positiva do lado direito, na qual todos os orifícios da coluna estão interligados. A entrada negativa é conectada ao lado oposto da matriz de contatos, onde, novamente, todos os orifícios de uma coluna estão conectados entre si. No centro, entre os dois conjuntos de colunas, há várias fileiras de cinco células, cada uma independente das demais. Todos os orifícios em uma fileira de cinco são interconectados, mas isolados das outras fileiras. Consulte a Figura 2. As regiões destacadas indicam quais partes da matriz de contatos estão interligadas. Um vídeo útil sobre o uso da matriz de contatos pode ser encontrado online em http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related
Exercício 1
Use a Lei de Ohm para calcular a CORRENTE que flui através do seguinte circuito:
Corrente (Rede 1): ________________ A
Exercício 2
Meça a tensão sobre o resistor, a resistência do resistor e a corrente que flui através do circuito acima (Rede 1).
Figura 3: Voltímetro Wavetek Meterman.
Monte o Circuito 1 na placa de prototipagem usando um resistor de 1500 Ω; o PowerLab atua como fonte de tensão (1,5 V). As medições de tensão, corrente e resistência são realizadas com o voltímetro. Para que o voltímetro obtenha dados precisos, ambas as ponteiras, vermelha e preta, devem estar em contato com fios descascados no circuito. Além disso, o seletor deve ser ajustado para tensão contínua (DC) em uma faixa apropriada para a escala de cada configuração experimental. Para a medição de tensão, encoste ambas as ponteiras do voltímetro nas duas extremidades do resistor. Ao medir a resistência do resistor (não a queda de tensão), DESCONECTE a fonte de tensão e, novamente, encoste ambas as ponteiras nas extremidades do resistor. Para medir a corrente, o voltímetro deve estar em SÉRIE no circuito; observe que as ponteiras vermelha e preta devem estar orientadas corretamente em relação ao sentido do fluxo de corrente.
Tensão (Rede 1): ________________V
Resistência (Rede 1): ________________Ω
Corrente (Rede 1): ________________A
Agora, com o Power Lab, meça a tensão no circuito 2 (igual ao circuito 1, mas em uma placa de prototipagem), da mesma forma que fez com o voltímetro. Desconecte o voltímetro e conecte os cabos da sonda de medição de tensão com as presilhas vermelha e preta. Em seguida, use o cursor para clicar em "Canal 1" (lado direito da tela). Clique e vá até "amplificador de entrada". Depois, na caixa, clique no botão "diferencial" e defina a faixa em 5 V. Clique em "OK" para salvar as alterações.
Clique em "Iniciar" (cant inferior direito) para coletar os dados. Pode-se interromper a qualquer momento para medir os desvios de tensão. Para medir a tensão coletada, clique em "Parar" e use o cursor "M" (cant inferior esquerdo), arrastando-o até a linha de base. Em seguida, use o cursor livre até o ponto mais alto do traçado da tensão para medir a amplitude. Leia a variação de tensão (ΔV) e anote os dados em papel. É possível confirmar os resultados com o voltímetro independente.
1.4) Resistência e Condutância em Série
Princípio do divisor de tensão: A queda de tensão ao longo do total de todas as resistências em série é igual à tensão da fonte. A tensão em cada resistor individual depende da fração da resistência total que aquele resistor representa. Portanto:
Um par de resistores dividirá uma tensão na razão de suas resistências individuais.
Exercício 3
Calcule a queda de tensão em cada resistor na Rede 3. Verifique seus cálculos medindo a tensão real com o voltímetro e o software do laboratório de eletricidade, com a fonte de 1,5 V conectada.
REDE 3. Utilize os dois resistores indicados acima.
| Calculado: | Medido: |
| Tensão (Através de R1):_______V | Tensão (Através de R1): ________________V |
| Tensão (Através de R2):_______V | Tensão (Através de R2): ________________V |
1.5) Aplicação Biológica de Exemplo:
As diferentes propriedades elétricas do interior celular e da solução externa de uma célula nervosa ativa fornecem um exemplo de divisor de tensão. Esse circuito biológico pode ser investigado por meio de registros obtidos com eletrodos externos. A região ativa da célula nervosa, onde os íons entram, atua como uma fonte de tensão; a corrente flui a partir dessa região ao longo do interior da célula e retorna através da solução externa. Assim, entre dois pontos da membrana que diferem em potencial, há um fluxo de corrente, necessariamente o mesmo dentro da fibra e fora dela; como a resistência interna é maior do que a externa, a maior queda de tensão ocorre aqui.
Considere o sistema e seu circuito equivalente (Figura 4: A. e B.):
Circuito Equivalente:
Figura 4: A (superior). Fluxo elétrico de corrente através de uma membrana celular biológica. B (inferior). Circuito elétrico equivalente. A fonte de tensão (120 mV) é a tensão transmembrana gerada pelo potencial de ação da célula nervosa.
Observação: R0 e Ri estão, na verdade, em série (não em paralelo), devido à posição da fonte de alimentação. Uma representação equivalente do circuito é a seguinte:
Figura 5: Circuito elétrico equivalente alternativo para a Figura 4A.
Exercício 4.
Dado que:
Vm, potencial através da membrana = 120 mV
Ri, resistência do fluido interno = 106 Ω
R0, resistência do fluido externo = 104 Ω
Calcule V0, o potencial entre os eletrodos A e B.
V0: ________________V
Exercício 5.
Utilizando a Rede 4 (veja abaixo), meça os potenciais em cada resistor (R0 e Ri).
REDE 4. Conecte resistores de 4,7 K Ω e 10 K Ω em série com a fonte de 1,5 V:
Meça as tensões com o seu voltímetro.
Tensão (através de R0): ________________V
Tensão (através de Ri): ________________V
REDE 5: Igual à Rede 4, exceto que R0 = 1 K Ω
Observe que, na Rede 5, a resistência externa é muito menor (análoga à presença de muito fluido ou tecido inativo desviando os eletrodos), daí a importância de registrar os sinais dos nervos no ar ou sob óleo isolante, para aumentar a resistência externa.
Tensão (através de R0): ________________V
Tensão (através de Ri): ________________V
1.6) Resistência e Condutância em Série e em Paralelo
Aplicação Biológica de Exemplo:
Um bom exemplo de resistências em série e em paralelo é a configuração elétrica de uma sinapse com transmissão química. A transmissão elétrica não é possível através da maioria das sinapses devido ao efeito de desvio provocado pelo espaço sináptico. Observe, no entanto, que esse desvio provavelmente é necessário para permitir o desenvolvimento de um potencial elevado através da membrana pré-sináptica, com liberação concomitante do neurotransmissor.
Figura 6: Modelo de fluxo eletroquímico através de uma sinapse.
Observe que em tecidos vivos, resistências elétricas significativas são formadas nas membranas e nos espaços extracelulares restritos. Espaços fluidos relativamente grandes, como o citoplasma celular ou as soluções de banho, não representam resistências significativas.
Exercício 6.
A Rede 6 (veja acima e a Placa de Circuito) é um análogo de uma sinapse química transmissora. Nas sinapses que transmitem eletricamente, a lacuna sináptica (resistência de desvio Rs) é eliminada e a corrente flui diretamente da célula pré-sináptica para a célula pós-sináptica através de Rm1 e Rm2, e depois através de Rm3. A atenuação da rede pode ser facilmente medida com diversos valores de resistor, ilustrando alterações em diferentes sinapses. Conecte seu PowerLab com 1,5 V (ou seja, configuração de 0,75 volt).
- Meça a diferença de potencial (DP) em cada resistor da rede fornecida, utilizando o multímetro. Anote os valores dos resistores. Faça uma observação especial da DP em Rm3 (a membrana da célula pós-sináptica). Tensão: ________________V
- Substitua o resistor de 330 Ω em Rs por um resistor de 330K Ω. Meça a DP em Rm3.
- Agora, mantendo Rs em 330K Ω, substitua o resistor de 330K Ω em Rm2 por um resistor de 33K Ω. Meça a DP em Rm3. Tensão: ________________V
- Agora, mantendo Rs em 330K Ω e Rm2 em 33K Ω, substitua o resistor de 22K Ω em Rm1 por um resistor de 220 Ω. Meça a DP em Rm3. Tensão: ________________V
Exercício 7
Um exemplo de rede resistiva série-paralela ocorre ao considerar as propriedades do cabo da fibra nervosa ou muscular. A CONSTANTE DE COMPRIMENTO de uma fibra é a distância ao longo da qual um PD através da membrana diminui para 37% do seu valor original. A atenuação é devida às resistências interna e externa do fluido em ambos os lados da membrana serem desviadas pela resistência transversal da membrana (relativamente alta). O valor da resistência limita a transferência de um sinal ao longo do axônio de uma célula nervosa. A constante de comprimento é 1/e, medida para uma decadência exponencial. dE/dT=-E/RC; onde E é a diferença de tensão, R é a resistência e C é a capacitância. Ou, em outra forma, E=Eoexp (-t/RC); onde Eo é a tensão inicial e t é o tempo em segundos. RC também é denominado tau (τ), a constante de tempo.
Assumindo que a resistência do fluido externo seja desprezível em comparação com as resistências intracelular e da membrana, as propriedades resistivas passivas da membrana podem ser representadas pelo seguinte circuito:
Figura 7: Tradução da Rede 7 para uma montagem em placa de prototipagem.
Aplique uma tensão em uma extremidade da Rede 7 entre A e B. Utilize um estimulador, selecionando um pulso de duração de 1 s, amplitude de 1 V (ajustada para 0,5 V) e frequência de 0,75 Hz. Conecte o voltímetro sucessivamente a cada resistor de "membrana" e anote a diferença de potencial (DP) através desse resistor. Mantenha uma extremidade da ponta do voltímetro fixa em (A-conector, vermelho), enquanto a outra ponta é movida sucessivamente pelas posições 1 a 5. Plote cada valor em um gráfico de DP versus "distância" da fonte, considerando os resistores de membrana separados por uma unidade de distância. A partir do seu gráfico, determine a constante de comprimento deste circuito. 
Gráfico da constante de comprimento da Rede 7:______________
O efeito de um aumento na resistência transversal da membrana, como ocorreria com uma bainha de mielina, ou de uma diminuição na resistência longitudinal interna da fibra associada a um aumento no diâmetro da fibra, é uma alteração na constante de comprimento. Os valores dos resistores não correspondem exatamente aos encontrados em um axônio nervoso, mas são aproximadamente proporcionais. Da mesma forma, a "distância unitária" no modelo é consideravelmente ampliada em comparação com uma célula nervosa real.
1.7) Capacitância
Os capacitores armazenam carga. Se uma tensão for aplicada a um capacitor por meio de uma resistência, a corrente flui para dentro do capacitor, e então a DD (diferença de potencial) através do capacitor aumenta exponencialmente com o tempo, aproximando-se da DD da fonte; o curso temporal dessa mudança de tensão depende da tensão aplicada, da capacitância e da resistência em série. Um curso temporal semelhante, mas invertido, é observado quando um capacitor se descarrega.
Conecte a entrada dessa simples rede Resistência-Capacitância (RC) ao seu estimulador, nos pontos A e B. Utilize pulsos de 1 V (ajustados para 0,5 V) com duração de 1 s e frequência de 0,75 Hz. Além disso, deve-se ajustar a aquisição para 20 K/seg (lado direito do painel). Conecte seus grampos de entrada do PowerLab através do capacitor. Adquira alguns segundos de sinal e depois pare. Use a janela de ampliação (Zoom) para expandir o tempo de subida em um dos pulsos quadrados. Pode ser necessário ampliar várias vezes para espalhar a curva. Meça o tempo de subida desde a linha de base até o topo da forma de onda de tensão, logo antes de ela se estabilizar. Observe o curso temporal da mudança de potencial e a distorção dos pulsos quadrados. Observe o efeito de substituir o capacitor de 10 μF por um de 0,1 μF. Ao conectar o probe de tensão do PowerLab através do resistor, é possível observar o curso temporal do fluxo de corrente pelo circuito. Adquira apenas alguns pulsos e depois pare para realizar a medida. Use o cursor "M" para posicionar na linha de base anterior à subida e o cursor livre no ponto onde a tensão começa a se estabilizar.
O último exemplo envolve componentes resistivos e capacitivos. As propriedades passivas de cabos em fibras nervosas e musculares são determinadas por elementos semelhantes, decorrentes das propriedades da membrana celular. Não apenas existe uma resistência transversal da membrana presente na célula, mas também uma capacitância da membrana, devido às propriedades elétricas da membrana celular. O efeito disso é influenciar o curso temporal do desenvolvimento de potenciais propagados eletrotonicamente.
Exemplo:
Esta rede pode ser construída a partir da Rede 7 conectando os capacitores necessários em paralelo aos resistores da membrana (Rm).
Exercício 8.
Conecte os capacitores de 10 μF à Rede 7. Usando pulsos de 1 s, 1 V (configuração de 0,5 V) e 0,75 Hz do estimulador, que deve ser conectado em A e B, observe as alterações de potencial em cada resistor de membrana. Assumindo que a tensão "limiar" (a tensão na qual um potencial de ação é gerado em uma célula nervosa) seja de 0,2 V, meça o tempo necessário para que o potencial atinja o limiar em cada resistor de membrana. Limiar aqui significa o valor de potencial no qual um potencial de ação pode ser gerado em uma célula viva. Plote seus resultados como tempo em função da 'distância'.
Figura 8: Tradução da Rede 9 para a montagem em placa de prototipagem.
Gráfico para a Figura 8.
Simule o efeito da diminuição da capacitância da membrana produzida pelo aumento da espessura da bainha de mielina substituindo os capacitores menores de 0,1 μF. Observe a alteração no tempo necessário para atingir o limiar em um resistor selecionado. Sobreponha os dados no mesmo gráfico com os capacitores maiores posicionados.
Em termos de uma membrana muscular, pode-se considerar um aumento na capacitância devido ao aumento da área superficial da membrana pelas túbulos T associados, o que resulta em uma capacitância de membrana maior em comparação com um neurônio. Capacitores menores podem ser usados para ilustrar a redução da capacitância provocada pela adição de mielina a um axônio nervoso não mielinizado. O ponto principal a ser aprendido aqui é que a capacitância elétrica é proporcional à área superficial e inversamente proporcional à espessura da camada dielétrica (mielina), que separa as "placas" ou superfícies armazenadoras do capacitor.
As propriedades apresentadas em um circuito modelo são observadas em preparações vivas. No entanto, as células variam em suas propriedades, como vazamento através da membrana e resistência axial. Algumas células não geram potenciais de ação. Contudo, um potencial de ação é produzido quando um sinal precisa ser transmitido ao longo de alguns milímetros, porque as propriedades elétricas passivas das células atenuam os sinais ao longo de alguns milímetros. Na próxima série de experimentos, a gravação de potenciais de ação é ilustrada.
1.8) Perguntas para os alunos
- Quais são alguns valores normais da constante de comprimento para neurônios e células musculares?
- O que aconteceria se uma membrana tivesse uma baixa resistência de membrana: a constante de tempo (tempo para atingir 63% do valor final) mudaria? Se sim, como ela mudaria com uma resistência de membrana mais baixa? Qual é a fórmula matemática generalizada para a constante de tempo (tau)?
- Por que axônios maiores, como o axônio gigante de lula, podem conduzir sinais elétricos mais rapidamente do que axônios menores no mesmo preparo de lula?
2. PROPRIEDADES DE CONDUÇÃO DAS CÉLULAS NERVOSAS
2.1) De uma placa de circuito a células vivas
As propriedades passivas demonstradas nos exercícios com placas de circuito também podem ser medidas em células vivas; no entanto, essas propriedades passivas podem ser complicadas de isolar quando acompanhadas por potenciais de ação em células nervosas. As propriedades ativas do neurônio são sua capacidade de manter um potencial de repouso da membrana, gerar potenciais de ação e regenerá-los ao longo de um trecho da membrana.
O fluxo elétrico ao longo de um cordão nervoso também pode ser regenerativo dentro de neurônios individuais e de um neurônio para o próximo. No cordão nervoso ventral (VNC) do lagostim, alguns neurônios se comunicam por meio de junções septadas (ou seja, junções do tipo gap). Como demonstrado nos exercícios anteriores com a placa de circuito, alterar a resistência pode dificultar a condução de sinais elétricos. Isso é análogo à alteração do fluxo de corrente através das junções do tipo gap no interior do cordão nervoso ventral.
A velocidade de condução e outras propriedades do potencial de ação composto na VNC são examinadas na próxima série de experimentos. Demonstraremos como obter a VNC para experimentação e como provocar e medir as respostas utilizando equipamentos padrão projetados para laboratórios didáticos para estudantes.
2.2) A preparação do lagostim
O cordão nervoso ventral do lagostim é o mais adequado para este experimento. O nervo é facilmente dissecado, e uma variedade de protocolos que afetam a condução pode ser utilizada com este preparo. Antes de iniciar este experimento, familiarize-se com os termos de anatomia do lagostim abaixo:
Figura 9. Diagrama geral da anatomia do lagostim.
Modificado de: http://www.enchantedlearning.com
2.3) Fundamentos da condução em um nervo
A medula nervosa ventral do lagostim atua na transmissão de sinais que iniciam respostas de fuga, como a reação de movimento da cauda. Neste experimento, serão realizadas gravações a partir da medula nervosa inteira e intacta. Os potenciais individuais de cada neurônio dentro da medula nervosa somam-se, gerando o potencial de ação composto, que fornece os pulsos elétricos mensuráveis mostrados pelo software de gravação. Erlanger, Gasser e Bishop (1924) são alguns dos pioneiros que descreveram os potenciais de ação compostos. São demonstradas as características do período refratário, da velocidade de condução e dos efeitos neurais do inibidor de junções comunicantes 1-heptanol ou da temperatura. O aprendizado dos princípios básicos dos sinais das células nervosas contribui para uma melhor compreensão da função neurológica em geral (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).
2.4) Materiais
| Item | Quantidade |
| Camarão-da-lama grande (Procambarus clarkii) | 1 |
| Pinça cirúrgica de precisão | 1 |
| Pinceta | 1 |
| Câmara de nervo MLT016/X | 1 |
| Computador portátil com software Scope | 1 |
| PowerLab | 1 |
| Amplificador PowerLab | 1 |
| Cabo de saída estimuladora para PowerLab | 1 |
| Conector USB PowerLab/Computador | 1 |
| Suporte com eletrodo de sucção | 1 |
| Pipeta de vidro com bulbo | 1 |
| Béquer com solução salina para camarão-da-lama | 1 |
2.5) Métodos
2.5.1) Dissecação
Certifique-se de que o recipiente para nervos, os diversos instrumentos e as soluções estejam preparados antes de dissecar um camarão-de-água-doce.
- Envolva o lagostim em um papel toalha úmido para segurá-lo ou segure-o com uma mão, mantendo as garras (quelípedes) entre o polegar e o indicador.
- Com a outra mão, faça uma incisão com a tesoura através do rostro, entre as órbitas oculares.
- Continue cortando para baixo a partir da incisão até que a cabeça seja completamente separada.
- Faça uma incisão na base do cefalotórax, acima do abdome; remova a cauda. (Se necessário, os quelípedes e patas locomotoras podem ser removidos para facilitar esse procedimento.)
- Remova os nadadeiros (swimmerets).
- Faça um corte ao longo de ambos os lados da face ventral do abdome. Tenha cuidado para não danificar os tecidos mais profundos.
- Levante a seção solta do exoesqueleto até a base do leque caudal para expor o cordão nervoso ventral.
- Usando a borda da pinça, remova cuidadosamente o cordão nervoso ventral pela ponta. Tenha cuidado para não esticar nem esmagar o cordão nervoso. (Qualquer nódulo observado no cordão nervoso corresponde aos gânglios do lagostim.)
- Estenda o cordão nervoso sobre as barras metálicas na câmara nervosa. É essencial manter o cordão nervoso ventral úmido. Para isso, adicione solução salina para lagostim suficiente na câmara nervosa até que o nível alcance a altura das travessas metálicas. Em seguida, pipete parte da solução salina para lagostim de modo que o líquido entre em contato apenas com a parte inferior das barras.
Salina para Lagostim (mM: 205 NaCl; 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES ajustado para pH 7,4) - Uma vez posicionado o nervo, conecte o cabo do estimulador com os dois eletrodos em gancho à câmara nervosa. Conecte o eletrodo vermelho positivo a um dos loops metálicos externos próximos à extremidade do cordão nervoso; conecte o eletrodo preto negativo ao loop metálico adjacente mais próximo ainda em contato com o cordão nervoso.
- Posicione o eletrodo de sucção no manipulador próximo à extremidade oposta do nervo.
- Succione cuidadosamente a ponta do cordão nervoso ventral para dentro do eletrodo de gravação.
2.5.2) Gravação
Uma vez que a ponta da medula espinhal seja aspirada para dentro do eletrodo de registro, certifique-se de que o eletrodo esteja conectado à sonda e de que a sonda esteja adequadamente aterrada. Isso pode ser feito simplesmente conectando o cabo de terra à gaiola de Faraday. Os fios positivo e negativo do eletrodo de sucção também devem ser conectados aos locais correspondentes na sonda. A sonda deve ser conectada ao amplificador diferencial, que, por sua vez, está ligado ao PowerLab.
Conecte os fios elétricos do eletrodo de sucção ao estágio principal. Os fios devem ser conectados com o vermelho (positivo) no canto superior esquerdo, o verde (terra) no meio e o preto (negativo) na parte inferior. Isso está indicado na Figura 10 para o estágio principal abaixo. O fio terra pode simplesmente ser colocado no banho de solução salina. Assim, um fio do eletrodo de sucção deve ir à entrada + e o outro à entrada -. Não importa qual dos fios do eletrodo de sucção vá para as entradas + ou -.
Figura 10: Entradas para o estágio principal
As configurações do amplificador são as seguintes:
| CONTROLE | CONFIGURAÇÃO |
| Passa-alta | CC |
| Filtro rejeita-faixa | DESATIVADO |
| Passa-baixa | 20kHz |
| Compensação de capacitância | Sentido anti-horário |
| Botão de ajuste fino e grosso de offset de CC | Sentido anti-horário |
| Offset de CC (+OFF) | DESATIVADO |
| Botão de ganho | 50 |
| Entrada (DIF MONO GND) | DIF |
| MODO (ESTIM-PORTA-REC) | PORTA |
| TESTE Ω | DESATIVADO |
Conecte o cabo USB fornecido à parte traseira do PowerLab e à tomada do computador. Abra o software Scope na área de trabalho do computador. No canto superior direito da tela, selecione "Canal 2" e desligue. Ajuste a tela para que somente o Canal 1 seja exibido, arrastando a barra localizada no meio da tela até a parte inferior. Em seguida, clique em "Amplificador de Entrada" para o canal 1, localizado no canto superior direito da tela. Selecione o seguinte:
| CONTROLE | CONFIGURAÇÃO |
| FAIXA | 500 mV |
| CA | MARCADO |
| BAIXA PASSAGEM | DESATIVADO |
| EXTREMIDADE ÚNICA | MARCADO |
| INVERTER | MARCADO |
Em seguida, novamente em "Configurar", clique em "Amostragem". Na caixa intitulada "Varredura" na tela que aparecer, selecione o seguinte:
| CONTROLE | CONFIGURAÇÃO |
| MODO | MÚLTIPLAS |
| AMOSTRA | 100 VARREDURAS |
| FONTE | USUÁRIO |
| ATRASO | 0 SEGUNDOS |
Por fim, na guia "Configuração", selecione "Estimulador". Clique na caixa para desativar o "Estímulo Isolado". Escolha as seguintes configurações:
| CONTROLE | CONFIGURAÇÃO |
| MODO | MÚLTIPLA |
| ATRASO | 5 ms |
| DURAÇÃO | 1 ms |
| PULSO(S) | 2 |
| INTERVALO | 15 ms |
| FACA | 5 V |
| AMPLITUDE | 0.5 |
Veja "Base de Tempo" no painel direito. Altere "Amostra" para 1024 e "Tempo" para 200 ms.
Figura 11: Dois potenciais de ação compostos com intervalo de 15 ms entre estímulos, conforme registrado com o software Scope.
Exercício 1.
Selecione o botão "Start" no canto inferior esquerdo da tela. Com as configurações acima, um potencial de ação composto bem definido deverá aparecer na janela de coleta de dados do Scope (Figura 11). Esboce a forma geral do potencial de ação no gráfico abaixo (Figura 12):
Figura 12: Gráfico em branco para esboçar a forma do potencial de ação composto.
Diminua lentamente a voltagem utilizando a aba no canto superior esquerdo da tela. O potencial de ação deve diminuir em magnitude até que seu padrão de onda característico também desapareça. A redução da voltagem diminui o número de neurônios recrutados para gerar o potencial de ação composto. Os axônios maiores provavelmente são os recrutados em voltagens mais baixas e são os de condução mais rápida, tendendo a aparecer primeiro no potencial de ação composto. Aumente a voltagem progressivamente para observar o efeito oposto; à medida que mais neurônios são recrutados, a onda do potencial de ação composto aumenta de tamanho. Este exercício ilustra o fato de que neurônios individuais possuem diferentes limiares para a geração do potencial de ação. Quando o potencial de ação composto não aumenta mais com o incremento da voltagem de estímulo, todos os neurônios já foram recrutados; devem ser visíveis na tela do computador dois picos distintos na onda do potencial de ação.
Exercício 2.
Após examinar o recrutamento de neurônios e o potencial de ação composto resultante, observe o efeito do período refratário. Isso pode ser feito aplicando dois estímulos próximos no tempo e variando o intervalo interestímulo, observando então em qual intervalo interestímulo o potencial de ação composto, provocado pelo segundo estímulo, apresenta amplitude reduzida em comparação com o primeiro potencial de ação composto. Altere o atraso entre os pulsos utilizando a aba no canto superior esquerdo da tela. Continue reduzindo o atraso até que o segundo potencial de ação composto não possa mais ser provocado. O tempo entre os pulsos em que um segundo potencial de ação já não é mais provocado é o período refratário absoluto. O tempo entre o fim do período refratário absoluto e o momento em que um segundo estímulo gera um potencial de ação com amplitude total é denominado período refratário relativo. Forneça uma estimativa dos períodos refratários absoluto e relativo nos espaços fornecidos.
Período Refratário Absoluto: ___________________
Período Refratário Relativo: ___________________
2.5.3) Medição da velocidade de condução
Com uma régua milimetrada, meça a distância entre o fio estimulante mais próximo ao eletrodo de registro e o próprio eletrodo de registro. A partir do traçado registrado, meça o tempo até os diferentes picos dos eventos no potencial composto, de modo que você possa registrar a velocidade de condução dos diversos sinais elétricos. Converta a distância em milímetros para metros e o tempo em milissegundos para segundos, a fim de obter unidades em metros por segundo.
Velocidade de condução do 1º formato de onda: __________________
Velocidade de condução do 2º formato de onda: __________________
Velocidade de condução do 3º formato de onda: __________________
Velocidade de condução do 4º formato de onda: __________________
2.5.4) Manipulação das junções comunicantes e/ou velocidade de condução
Em seguida, investigue as propriedades de um inibidor neuronal. O efeito desacoplador do heptanol foi descrito pela primeira vez em axônios septados de lagostim (ou seja, junções comunicantes) por Johnston et al. (1980). Esse efeito relacionado à comunicação elétrica foi logo confirmado em diversos sistemas de vertebrados e invertebrados (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Para compreender o papel da comunicação elétrica nesta corda nervosa ventral, pode-se utilizar uma solução salina contendo 1-heptanol (1 mM) para desacoplar as junções comunicantes. Com uma pipeta de vidro, lave toda a extensão da corda nervosa com uma solução de heptanol. Observe a alteração registrada pelo software de aquisição de dados Scope e resuma-a. (Observe a mudança na forma de onda e se a velocidade de condução das formas de onda foi alterada). Alternativamente, em vez de usar 1-heptanol, pode-se substituir o salino de banho por salino gelado e monitorar qualquer alteração na forma de onda ou na velocidade de condução das formas de onda.
Discussão
Nosso objetivo na apresentação de vídeo on-line e este trabalho é demonstrar que as propriedades biofísicas das células pode, em parte, ser modelado como circuitos elétricos. Além disso, com o tecido neural ao vivo que é relativamente fácil de obter, princípios fundamentais da velocidade de condução, períodos refratários e técnicas de gravação eletrofisiológicas são possíveis para os laboratórios de estudante de graduação com modesto investimento de equipamento. Os temas e paradigmas fundamentais apresentadas podem ser facilmente modificados para as necessidades de diferentes cursos.
Manutenção de lagostas e sua abundância torna modelos mais atraentes para estudantes-driven experimentação. Cordões nervosos crustáceo ventral são geralmente robusto e manter a integridade fisiológica em uma solução salina mínima de horas, que é adequada para um laboratório de estudante três horas.
Dado que alguns dos grandes axônios no VNC do lagostim são conectados através de junções, a experimentação adicional sobre a sua contribuição pode ser realizada, e propriedades diferentes do que o encontrado no padrão preparação nervo ciático de rã pode ser demonstrada. O nervo ciático é um modelo clássico para abordar potenciais compostos de ação e propriedades de condução. Pode até ser uma experiência interessante comparativa para os alunos comparar as propriedades de condução, recrutamento axônio, e os períodos refratários entre essas duas preparações.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Estes experimentos foram modificados a partir de um manual de laboratório que tem sido utilizado em um curso, orquestrada pelo Dr. HL Atwood, no Departamento de Zoologia da Universidade de Toronto. Os exercícios também foram utilizados e modificados de um manual que foi produzido para "6 º WORKSHOP Ibro intensivo sobre neurociência básica" e foi realizado na Korea University, Seoul, Coreia do Sul em 1993 (Cooper et al., 1993). As modificações atuais eram obrigados a usar o equipamento comum para apresentar laboratórios dias estudante dirigido em várias universidades. Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.
Materiais
Placa de circuito
- Eletrônicos listados abaixo para os experimentos breadboard podem ser obtidas em uma loja local da eletrônica como a Radio Shack.
- Placa de pão, resistores, capacitores, baterias e fios que podem servir como cruzamentos para a breadboard, conforme descrito nos experimentos.
- Um voltímetro comum (Wavetek Meterman voltímetro)
- A / D para o conselho sobre a gravação de linha para um computador. Sinais elétricos são registrados na linha de uma interface PowerLab/4s (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Nós usamos software padrão de ADInstruments chamado gráfico ou Âmbito.
Experimentos fisiologia
- Lagostim (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EUA.
- Padrão lagostas salina: Modificado de solução de Van Harreveld (1936). (Em mM) 205 NaCl; 5,3 KCl, 13,5 CaCl 2 2H 2 O, 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 e HEPES pH ajustado para 7,4. Todos os produtos químicos salinos foram obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
- Ferramentas de dissecção: Fine # 5 pinças, tesoura fina, lâmina de faca, # 26002-20 pinos de insetos (todos obtidos a partir de Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
- Um prato câmara do nervo (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA) para conter o nervo. Os fios que vêm com o prato câmara do nervo pode ser usado para estimular o nervo.
- Um eletrodo de sucção é usada para registrar os sinais.
- O manipulador ou um grampo em um suporte de anel também servirá como um suporte para o eletrodo de sucção.
- Gaiola de Faraday
- Microscópio de dissecação
- Iluminador de Alta Intensidade (fonte de luz)
- Plataforma microscópio
- AC / DC Amplificador Diferencial (AM Sistemas Modelo Inc. 3000)
- PowerLab 26T (Instrumentos AD)
- Amplificador extracelular (AD Instruments)
- LabChart 7 (ADI Instruments)
- Ferramentas de dissecação
- Um anel de suporte e fixação para servir como um suporte para o eletrodo de sucção de gravação
Referências
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- Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
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