Nós fornecemos um protocolo passo a passo para a gravação de célula inteira patch clamp de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) correntes em sangue periférico mononuclear de células derivadas de linfócitos T humanos.
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Artigo de método
Todo-Cell Gravação de Cálcio O cálcio Release-Ativado (CRAC) Correntes em linfócitos humanos T
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em linfócitos T, a depleção de Ca 2 + intracelular do Ca 2 + loja leva a ativação de plasmalemmal Ca 2 + canais, chamados de cálcio Release-Activated cálcio (CRAC) canais. CRAC canais desempenham um papel importante na regulação da proliferação de células T e expressão gênica. Função de canal de anormal CRAC nas células T tem sido associada a doenças de imunodeficiência combinada severa e auto-imunes 1, 2. Estudar a função de canal CRAC em células humanas T pode descobrir novos mecanismos moleculares que regulam as respostas imunes normais e desvendar as causas de doenças relacionadas com o humano. Gravações eletrofisiológicas das correntes de membrana uma avaliação mais precisa das propriedades do canal funcional e sua regulamentação. Avaliação eletrofisiológica das correntes CRAC canal em células Jurkat T, um ser humano da leucemia de células T de linha, foi realizado mais de 20 anos atrás 3, no entanto, as medições atuais CRAC em condições normais de células T humanas permanece uma tarefa desafiadora. As dificuldades na gravação correntes canal CRAC em células T normais são agravados pelo fato de que os linfócitos T derivados do sangue são muito menores em tamanho do que as células T Jurkat e, portanto, o endógeno correntes de célula inteira CRAC são muito baixos em amplitude. Aqui, damos um procedimento passo-a-passo que usam rotineiramente para gravar o Ca 2 + ou Na + correntes através de canais CRAC em repouso células T humanas isoladas do sangue periférico de voluntários saudáveis. O método descrito aqui foi adotado a partir dos procedimentos utilizados para a gravação das correntes CRAC em células Jurkat T e ativação de células T humanas 4-8.
Protocolo
1. Preparação de repouso Linfócitos T Humanos
- Usando RosetteSep Humanos Cocktail de Enriquecimento de células T e Medium Density RosetteSep, purificar as células T a partir de amostras de sangue humano de acordo com as instruções do fabricante. A população de células resultante deve conter 95% CD3 + células T em repouso. Purificamos linfócitos T humanos a partir de amostras coletadas do sangue periférico de voluntários saudáveis, em conformidade com o protocolo aprovado pelo Internal UC Davis Board Review.
- Após o isolamento, descansando ressuspender as células T com uma densidade de 0,5 x 10 6 células / mL em meio de cultura....
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Discussão
A investigação eletrofisiológicos de correntes CRAC em repouso células T humanas é uma tarefa desafiadora, porque a amplitude CRAC de corrente endógena dessas células é pequeno devido ao tamanho de pequenas células (o diâmetro de células T humanas em repouso está na faixa de 5-8 mm). Aqui, apresentamos um procedimento passo-a-passo para registro confiável correntes CRAC em repouso linfócitos T humanas isoladas a partir de células mononucleares do sangue periférico. Esta tecnologia permite-nos investigar a fisiologia e e.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Somos gratos ao Departamento de Fisiologia e Biologia Molecular, Universidade da Califórnia Davis por nos fornecer instalações e um excelente ambiente para os estudos de canais iônicos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coquetel de Enriquecimento de Células T Humanas RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| Meio de Densidade RosetteSep | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| Meio RPMI 1640 com glutamina/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| Soro de Bezerro Fetal | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (solução 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| Solução de vitaminas RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| Solução de aminoácidos 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-Mercapt–etanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Trifosfato de inositol | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poli-L-Lisina Hidrobrometo | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Cloreto de lantânio | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| Tapsigargina | Calbiochem | 586005 | |
| Kit de Elastômero de Silício Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Revestimento Protetor para Semicondutores HIPEC R6101 | Dow Corning | ||
| Mesa de Laboratório de Isolamento de Vibração de Alta Performance Série 63-500 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| Amplificador de clamp de patch EPC 10 com estágio de cabeçote | HEKA Instruments | ||
| Micromanipulador | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| Microscópio invertido Olympus 1X71 com objetiva de imersão em óleo 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| Computador com Windows | Dell | ||
| Software Pulse | HEKA Instruments | ||
| Software de Gráficos e Análise Científica Origin | OriginLab | ||
| Puxador de pipetas para patch | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vidro borossilicatado com filamento (diâmetro externo: 1,5 mm e diâmetro interno: 1,10 mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microforja Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| Anéis O de silicone | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| Lâminas de cobertura de 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referências
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
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Reimpressões e permissões
