O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients
Neste artigo
Resumo
Resumo
Isolamento de células do sistema imunológico que se infiltrar no sistema nervoso central (SNC) durante a infecção, trauma auto-imunidade, ou neurodegeneração, é muitas vezes necessária para definir seu fenótipo e funções efetoras. Abordagens histoquímica são instrumentais para determinar a localização das células infiltrando e analisar o SNC patologia associada. No entanto, in-situ histoquímica e técnicas de coloração de imunofluorescência são limitados pelo número de anticorpos que podem ser usados em uma única vez para caracterizar os subtipos de células imunes em um tecido particular. Portanto, as abordagens histológicas em conjunto com imuno-fenotipagem por citometria de fluxo são fundamentais para caracterizar completamente a composição do CNS infiltração local. Este protocolo é baseado na separação do CNS suspensões celulares mais descontínua Percoll gradientes. O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para a identificação de várias populações de células imunes em uma única amostra por citometria de fluxo.
Protocolo
Preparação de reagentes
Prepare estoque isotônica Percoll (SIP), 4 ml por cérebro, através da mistura de 9 partes de Percoll com uma parte de HBSS 10X sem Ca + + e Mg + +.
Prepare SIP menos 70% em 1X HBSS sem Ca + + e Mg + +, 2 ml por cérebro dispensado em um tubo de polipropileno 15 ml.
Nota: Recomenda-se que Percoll deve ser usado em temperatura ambiente, se usado frio, as células tendem a aglutinar-se e separação celular é menos eficiente.
Coleta de tecido e homogeneização
Anestesiar ratos e perfundir através do ventrículo es....
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Discussão
Análises de marcadores de superfície celular no SNC leucócitos a partir de tecidos de rato normal e inflamado tem sido utilizado por várias décadas 1-3. Protocolos de isolamento são baseados na separação de microglia e leucócitos por 4 centrifugação densidade. Aqui nós descrevemos um método rápido e eficaz de isolar CNS leucócitos usando gradientes descontínuos de Percoll. Após o isolamento de células, coloração com anticorpos diversos, tais como, mas não se limitando a-CD45, CD4, CD8, CD11b, CD19,.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) e da Universidade do Texas em San Antonio.
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Materiais
Homogeneização do tecido e Gradients
- Percoll (Amersham)
- Solução Hanks 10X 'Salt equilibrado, sem cálcio e magnésio (Gibco)
- Meio RPMI 1640, sem vermelho de fenol (Gibco)
- 7-ml ou 15 ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Citometria de fluxo
- Tampão de células de coloração (Biolegend)
- Rat purificada Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD PharMingen
- Hemocitômetro (Fisher)
- Anti-camundongo CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- Phosphate Buffered Saline 10X, sem cálcio e magnésio (Thermo Scientific)
- Paraformaldeído (Sigma Aldrich)
- Citometria de fluxo realizados com um LSR II (BD Biosciences)
Referências
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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Reimpressões e permissões
