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Artigo de método

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

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DOI:

10.3791/2355

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26 de dezembro de 2010

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1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis, 2Département Génétique et Développement, Institut Cochin, Université Paris Descartes

Neste artigo

Resumo

Oligonucleotídeos podem ser usados ​​para o site substitua especificamente um único nucleotídeo de genes-alvo transfectadas em ambos os Anopheles gambiae E Anopheles stephensi Células.

Resumo

Parasitas Plasmodium, o agente causador da malária, é transmitida através da picada de mosquitos do gênero Anopheles infectados, resultando em mais de 250 milhões de novas infecções a cada ano. Apesar de décadas de pesquisa, ainda não há vacina contra a malária, destacando a necessidade de estratégias de controle romance. Uma abordagem inovadora é a utilização de mosquitos geneticamente modificados para controlar eficazmente a transmissão do parasita da malária. Alterações deliberadas de vias de sinalização celular no mosquito, através de mutagênese alvo, foram encontradas para regular o desenvolvimento do parasita 1. A partir desses estudos, podemos começar a identificar genes alvos potenciais para a transformação. Mutagênese alvo tradicionalmente tem invocado a recombinação homóloga entre um gene alvo e uma molécula de DNA de grande porte. No entanto, a construção e utilização de tais moléculas de DNA complexas para geração de linhagens celulares estavelmente transformada é o tempo, consumindo caros e muitas vezes ineficiente. Portanto, uma estratégia usando bloqueado ácidos nucleicos modificado oligonucleotides (LNA-ONs) fornece uma alternativa útil para a introdução artificial único substituições de nucleotídeos em metas epissomal DNA cromossômico e gene (revisto em 2). LNA-ON-mediada mutagênese alvo tem sido usado para introduzir mutações pontuais em genes de interesse em cultura de células de levedura e ratos 3,4. Mostramos aqui que LNA-ONs pode ser usada para introduzir uma mudança de nucleotídeo único em um alvo transfectadas epissomal que resulta em um interruptor de azul proteína fluorescente expressão (BFP) para expressão de proteína verde fluorescente (GFP) em ambos os Anopheles gambiae e Anopheles stephensi células . Esta conversão demonstra pela primeira vez que mutagênese eficaz de genes alvo em células de mosquito pode ser mediada por LNA-ONs e sugere que esta técnica pode ser aplicável a mutagênese de alvos cromossômicas in vitro e in vivo.

Protocolo

  1. Antes de iniciar o protocolo, é importante determinar que as células de mosquitos utilizados no experimento são saudáveis ​​e na confluência ~ 80% se aderente (Figura 1). Abandonada células ou insalubre resultará em eficiência de transfecção baixo e dará resultados inconsistentes.
  2. Aquecer toda a mídia antes do uso em um banho de água 28 ° C por 30 minutos.
    1. A. stephensi MSQ43 células requerem E5 médio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de calor FCS inativada, 0,2% D-glucose, 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina, e 1% não-aminoácidos essenciais.
    2. Células A. gambiae SUA5B exigem médias S2: Drosophila Schneider média, 5% de calor FCS inativada, e 1% de penicilina-estreptomicina antibiótico
  3. Descongelar e armazenar todos os materiais reagentes de transfecção, plasmídeos, e oligonucleotides no gelo.
  4. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de cultura de tecido usando a técnica estéril.
  5. Para células aderentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirado de fora a velha mídia, sem perturbar as células, adicionar um volume equivalente de mídia fresco que foi aquecido a 28 ° C, e em seguida enxaguar as células da parte inferior do frasco utilizando uma pipeta.
  6. A concentração de células deve ser determinada e ajustada para uma concentração final de 1x10 6 células / mL. As células podem ser mantidas à temperatura ambiente durante a preparação de materiais reagentes de transfecção.
  7. Adicionar 1 mL de células de mosquito (1x10 6 células / mL) a cada poço de uma placa de seis poços. Configurar uma placa para cada condição experimental (ver abaixo).
    Tabela I é um esquema de pipetagem para uma transfecção geral. Tabela II apresenta cinco condições para testar a mutagênese bem-sucedida de um único nucleotídeo usando BFP específicos LNA-ons. Os dois primeiros, e pGFP pBFP, são controles positivos e negativos, respectivamente. Os restantes são condições experimentais de pBFPs com concentrações crescentes de BFP específicos LNA-ons. Em etapas de 8 a 12, adicionar volumes de reagente apropriados de acordo para cada condição.
  8. Transferência de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL e adicionar o volume adequado de tampão de CE.
    1. Para 1 mL de DNA plasmídeo (1 mg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE.
    2. Para 1 mL pGFP (1μg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE.
    3. Para 1 mL pBFP (1μg / mL), adicionar 99 mL de tampão CE.
    4. Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 1 mL ON (mcg / mL), adicionar 98 mL de tampão CE.
    5. Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 5 mL ON (1μg / mL), adicionar 94 mL de tampão CE.
    6. Para 1 mL pBFP (1μg / mL) e 10 mL ON (1μg / mL), adicionar 89 mL de tampão CE.
  9. Em seguida, adicionar lentamente Enhancer por 1 mg de DNA usado.
    1. Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicionar 8 mL Enhancer.
    2. Para 1 pGFP mL, adicionar 8 mL Enhancer.
    3. Para 1 pBFP mL, adicionar 8 mL Enhancer.
    4. Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 16 mL Enhancer.
    5. Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 48 mL Enhancer.
    6. Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar 88 mL Enhancer.
  10. Vortex DNA / buffer / Enhancer mistura por 1 segundo e certifique-se toda a solução está no fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente por 5 min.
  11. Adicionar reagente Effectene por 1 mg de DNA plasmídeo e vortex por 10 seg. Confirmar que toda a solução está no fundo do tubo e incubar à temperatura ambiente por 10 min.
    1. Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicionar 10 mL Effectene (Tabela I).
    2. Para 1 pGFP mL, adicionar 10 mL Effectene (Tabela II).
    3. Para 1 pBFP mL, adicionar 10 mL Effectene (Tabela II).
    4. Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 20 mL Effectene (Tabela II).
    5. Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 60 mL Effectene (Tabela II).
    6. Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar 110 mL Effectene (Tabela II).
  12. Trazer cada tubo para um volume final de 1000 mL, adicionando media aquecido gota a gota à mistura de DNA / buffer / Enhancer / Effectene. DNA pode precipitar neste momento se a mídia for adicionada muito rapidamente. Misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes.
    1. Para 1 mL de DNA plasmídeo, adicione 882 mL de mídia (Tabela I).
    2. Para 1 pGFP mL, adicionar mídia mL 882 (Tabela II).
    3. Para 1 pBFP mL, adicionar mídia mL 882 (Tabela II).
    4. Para 1 pBFP mL e 1 mL ON, adicionar 864 mL de mídia (Tabela II).
    5. Para 1 pBFP mL e 5 mL ON, adicionar 792 mL de mídia (Tabela II).
    6. Para 1 pBFP mL e 10 mL ON, adicionar media 702 mL (Tabela II).
  13. Em seguida adicione lentamente 1 mL da mistura de DNA / Enhancer / Effectene apropriada a cada poço uma gota de cada vez.
  14. Agite ligeiramente a placa para garantir a distribuição uniforme das células e mistura de transfecção. Incubatcélulas e em condições de crescimento normal.
  15. Um dia após a transfecção, aspirar cuidadosamente para fora da mídia e, lentamente, substitua-o por um volume equivalente de mídia recém-aquecido. É importante para não perturbar as camadas de células no fundo dos poços ao fazer isto.
  16. Dois dias após transfecção examinar células transfectadas com controle positivo pGFP sob microscópio de fluorescência para determinar a eficiência de transfecção (Figura 2).
  17. SUA5B células crescem muito rapidamente e se tornará overgrown. Quatro dias após transfecção destas células finas por aspiração a velha mídia e adicionando lentamente um volume equivalente a mídia recém-aquecido.
  18. Após a adição de novas mídias para os poços, retire todas as células do fundo de cada poço por pipetagem cima e para baixo, descarte de metade do volume (1 mL) da mistura de células e adicionar 1 mL de mídia fresco aquecido para trazer o volume final de 2 mL.
  19. Verifique células diariamente para se certificar que estão saudáveis ​​e não cobertas, fino, se necessário.
  20. Permitir que as células a crescer sob condições normais de 5-7 dias após transfecção antes de recolher-los para análise.
  21. Em 5-7 dias após a transfecção, coletar as células por aspiração ao largo da velha mídia em todos os poços e adicionar 1 mL de PBS estéril à temperatura ambiente a cada poço.
  22. Separar as células de fundo do poço por pipetagem cima e para baixo e transferir a mistura de células para tubos de 5 mL tampa de pressão e analisar imediatamente as células através de citometria de fluxo.

Resultados representante

Figura 1
Figura 1. Untransfected A. saudável stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) células em cerca de 80% confluência.

Figura 2
Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) células transfectadas com GFP controle positivo expressando plasmídeo.

Figura 3
Figura 3. Citometria de fluxo de dados confirmando a conversão de BFP GFP via mutagênese transfecção de um único nucleotídeo seguinte com BFP específicos bloqueado ácidos nucleicos modificado oligonucleotides (LNA-ONs). SUA5B células foram transfectadas com um plasmídeo expressando GFP (pGFP) como controle positivo, com um plasmídeo expressando BFP (pBFP) como controle negativo, ou com pBFP e concentrações crescentes de BFP específicos LNA-ons. (A) estratégia Gating de dados de citometria de fluxo mostrando da esquerda para a direita: dispersão frontal versus lado de células vivas, iodeto de propídio (PI) células negativas, e as células GFP positivas cinco dias após a transfecção. (B) Gráfico de porcentagem de células GFP positivas mostrado em (A) transfecção seguinte com pBFP e concentrações crescentes de LNA-ons.

Tabela 1
Transfecção tabela I. condições.

Tabela 2
Tabela II. Condições Transfection usado na Figura 1.

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Discussão

Aqui apresentamos um método in vitro e evidências para a conversão alvo de um único nucleotídeo em um gene alvo epissomal seguintes transfecção de LNA-ONs em A. stephensi e A. células gambiae. LNA-ON-mediada conversão gene requer indução de um site-specific resposta de reparo do DNA; nossos dados indicam que as células de mosquito pode suportar este mecanismo de site-specific mutagênese. Enquanto o método aqui apresentado é baseado na conversão de um alvo epissomal, nossos da...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Abbie Spinner no Centro de Pesquisa California National Primate por sua assistência com citometria de fluxo. Este estudo foi suportado por financiamento do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente de transfeção EffecteneQiagen301425
Plasmídeo controle GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)InvitrogenK4935-00
Plasmídeo BFP (pcDNA5/FRT/TO)Doação do Dr. Concordet3
ONs com LNADoação do Dr. Concordet3
MEM, Earle’s com glutaminaInvitrogen11095
Soro bovino fetal (FBS)Invitrogen16000
Meio Drosophila de Schneider’sInvitrogen11730
Ácidos aminoácidos não essenciaisInvitrogen11140
D-glucose a 10%Sigma-AldrichG5767
Antibiótico penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140
Placas de cultura de 6 poçosCorning3516

Referências

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

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