Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

Resumo

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Resumo

Os primeiros passos na visão dos vertebrados ocorrem quando a luz estimula a bastonetes e cones da retina ^1. Essas informações são então segregados em que são conhecidas como as vias de ON e OFF. A informação do sinal fotorreceptores de luz para as células bipolares (BCs), que despolarizar em resposta ao aumento (On ​​BCs) ou diminui (Off BCs) na intensidade da luz. Essa segregação da informação luz é mantido no nível das células ganglionares da retina (RGCs), que têm dendritos estratificação em qualquer sublamina o Off da camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entrada excitatória direta de Off BCs, ou estratificação em o sublamina On do IPL, onde recebem entrada excitatória direta de On BCs. Essa segregação de informações sobre aumentos ou diminuições de iluminação (a On e Off caminhos) é conservada e sinalizada para o cérebro em paralelo.

O RGCs são as células de saída da retina, e são, portanto, uma célula importante para o estudo, a fim de entender como a informação de luz é um sinal para os núcleos visuais no cérebro. Avanços da genética do rato nas últimas décadas resultaram em uma variedade de linhas repórter fluorescente mouse onde populações específicas RGC são rotulados com uma proteína fluorescente para permitir a identificação de subtipos RGC ^{2 3 4} e específicas destinadas para gravação eletrofisiológico. Aqui, apresentamos um método para a gravação respostas luz de células ganglionares fluorescente etiquetado em um intacto, isolado de retina. Esta preparação isolada da retina permite gravações de RGCs onde o arbor dendríticas está intacta e as entradas em todo o arbor dendríticas toda RGC são preservadas. Este método é aplicável em uma variedade de subtipos de células ganglionares e é passível de uma grande variedade de uma única célula técnicas fisiológicas.

Protocolo

Declaração de Uso de Animais: Os animais foram tratados de acordo com orientações descritas no Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, usando protocolos aprovados pela Universidade de Minnesota Animal Care Institucional e Comitê de uso.

1) Preparação das soluções

1. Antes de realizar a gravação eletrofisiológico, soluções intracelular, extracelular e enzimas precisam estar preparados.
2. Solução extracelular: uma garrafa de mistura (8.8g) de meio de pó de Ames (Sigma) com 1 l de H ₂ O e 1,9 g de bicarbonato de sódio (23 mM). Em todos os pontos da solução extracelular está saturado com 95% O ₂ / 5% CO ₂ da mistura de gases. Transferência de 200 mL para um copo para armazenamento de retina. Coloque a solução restante no recipiente de sistema de perfusão para a perfusão gravidade uma vez retina está montado.
3. Solução intracelular: solução intracelular deveria ter sido feito anteriormente e depois aliquotado em alíquotas 500-1000 mL e armazenadas a -20 ° C. Solução intracelular varia de acordo com a experiência necessária, para gravações de pinça de corrente mostrado aqui usamos (em mM): 125 K gluconato, 2 CaCl _2, MgCl 2 _2, EGTA 10, 10 HEPES, 2-Na ₂ ATP, 0,5 mM NaGTP pH para 7,2 com KOH ^5. Um traçador fluorescente como 10 mM Alexafluor-594 hidrazida (Invitrogen) podem ser adicionados para visualizar dendrites durante o experimento, e neurobiotin (0,3%) também podem ser incluídos para a análise da anatomia das células após a gravação. Quando estiver pronto para gravar, descongelar solução intracelular.
4. Solução enzimática: Combine 10000 Unidades colagenase (Chemicals Worthington) com 83 mg Hialuronidase (Chemicals Worthington) em 4,150 mL de solução extracelular. Loja em 50 mL alíquotas a -20 ° C. Alíquotas pode ser usado por várias semanas. Quando estiver pronto para tratar a retina, diluir em 500 mL alíquota de bolhas solução extracelular.
5. De fosfato tamponada (PBS): Em 800 mL de H ₂ O adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na ₂ HPO ₄ e 0,24 g de KH ₂ PO _4. Trazer o pH para 7,4 com NaOH. Ajustar o volume para 1 L.
6. 0,2 M de tampão fosfato: Em 800 ml de H ₂ O adicionar 21,8 g de Na ₂ HPO ₄ e 6,4 g de NaH ₂ PO _4. Trazer volume de 1 L.
7. Solução de paraformaldeído 4%: Heat 50ml H ₂ O a 60 ° C. Adicionar paraformaldeído 4g, mexa por alguns minutos. Adicione algumas gotas de NaOH 1M (cerca de 5 gotas), continue a mexer até que a solução é clara. Adicionar 50 ml de tampão fosfato 0,2 M em béquer. Verificar o pH com tiras de pH (~ 7,4). Filtro e cool.
8. Solução de bloqueio (soro de cabra 10%, 0,5% TritonX100): Em 1,8 ml de PBS adicionar 0,2 ml de soro de cabra e 10 mL Triton X-100. TritonX-100 serve para permeabilise o tecido.
9. Estreptavidina solução (soro de cabra 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 Estreptavidina 594): Em 1,9 ml de PBS adicionar 0,1 ml de soro de cabra, 10 mL Triton X-100 e 4 mL de Estreptavidina 594.

2) Isolamento de retina de rato

Ferramentas de dissecção necessários: 1 # 2 Pinça, 2 # 5 pinças, tesouras oftalmológica

1. Euthanize do mouse de acordo com protocolos aprovados, neste caso, CO ₂ asfixia e globo ocular enuclear suavemente inserir um ângulo # 2 pinças atrás do olho e levantando o globo ocular.
2. Lugar do globo ocular em uma placa de Petri 35 mm com solução extracelular. Cortar o nervo óptico e qualquer músculos extra-oculares associadas ou tecido conjuntivo com uma tesoura oftalmológica. Cortar a córnea com uma tesoura oftalmológica e retirar a lente usando # 5 fórceps. Rasgar a esclera usando um par de fórceps # 5 e use a pinça para cortar o nervo ótico, onde a retina ea esclera se encontram no disco óptico. Descascar delicadamente a retina de distância da ocular. Dica: Faça cada passo em ambas as retinas antes de passar para a próxima etapa para minimizar o tempo.
3. Use uma pinça para remover vítreo ligado à retina. Isto pode ser realizado por "agarrar" o vítreo transparente acima da retina com uma pinça. O vítreo, se removido com êxito, deve ser visível como uma substância clara e gelatinosa sobre o fórceps. Dica: Cortar pela metade retinas remoção do vítreo seguinte irá maximizar a quantidade de tecido utilizável e fazer a montagem na câmara mais fácil.
4. Manter o retinas em solução extracelular oxigenada à temperatura ambiente em um ambiente escuro com luz ambiente mínima até que estejam prontos para ser digerida. Retinas pode ser armazenado desta forma para a 6 horas.

3) O tratamento da retina com a mistura de enzima e de montagem na câmara de gravação

1. Diluir uma alíquota de colagenase / hialuronidase em 500 mL de solução extracelular, a solução de colocar em um prato de Petri 35 mm e transferir a retina.
2. Manter a retina contêming placa de Petri, coberta e na escuridão, em 95% O2 / 5% CO ₂ ambiente por 15 min com agitação suave. Este passo ajuda na digestão de qualquer vítreo restantes e permite fácil acesso à camada de células ganglionares. Dica: para retinas de animais mais jovens com menos vítreo ou se os efeitos adversos são observados, o tempo pode ser reduzido para aproximadamente 5 minutos.
3. Remover retina de enzimas contendo meio e lave bastante em solução extracelular
4. Transferir a retina na gravação da câmara ⁶ com a camada de fotorreceptores virada para baixo. Wick longe líquido restante com um pipeta ou tecido e um roll out lados da retina para achatar tecido que está sendo cuidado para tocar somente nas bordas da retina, principalmente evitando o contato com a camada de células ganglionares. Coloque um anel de platina com malha de nylon mais de retina para ancorar o tecido e imediatamente preencher a câmara com solução extracelular.
5. Monte a câmara de gravação para o palco microscópio, anexar tubo para perfusão gravidade e sucção a vácuo e anexar fio terra.

4) A localização das células ganglionares EGFP expressar e estimulação luminosa

1. Perfundir a retina por gravidade com solução extracelular em uma taxa mL / min ou mais rápido. Dica: Se a taxa de perfusão é muito lento, o tecido não serão suficientemente oxigenado e sinalização sináptica pode ser interrompido.
2. Preencha uma pipeta de gravação com a solução intracelular e inseri-lo no suporte da pipeta. Dica: Pipetas com resistências na faixa de 3 a 5MΩ dar os melhores resultados.
3. Visualizar a retina sob infravermelho contraste de interferência diferencial (DIC) óptica com pequeno aumento (objetiva de 10X, NA 0,3) para localizar a pipeta de gravação. A luz infravermelha é usada para minimizar a exposição da retina à luz visível e minimizar adaptação luz. Mover-se para maior ampliação (objetiva de 40X, NA 0,8) e trazê-eletrodo à vista logo acima do tecido.
4. Em grande aumento (objetiva de 40X), iluminam a retina com epifluorescência (480 nm para EGFP) e selecione um gânglio fluorescentes e marca no monitor do computador com fita (Figura 1A).
5. Sob iluminação DIC e infravermelho, a posição do eletrodo de registro junto à células ganglionares específicas (Figura 1A). Limpe a área imediatamente cobrindo celular através da aplicação de pressão positiva suave para eletrodo de registro por meio de uma seringa de plástico 12cc conectados ao titular da pipeta com tubulação de polietileno. No amplificador, zero qualquer offsets de tensão. Eletrodo lugar em células ganglionares selecionado até que uma ondulação aparece na superfície da célula.
6. Com o amplificador no modo braçadeira de tensão, aplicar um pulso de teste e monitorar a passagem de corrente através da pipeta. Aplicar pressão negativa para criar vedação entre eletrodo e da célula. Liberação de pressão negativa quando a célula começa a vedação e espere até que corrente de retenção é indicativo de um selo GÊ elétrica entre a membrana da célula e pipeta. Aplicar suaves impulsos de pressão negativa até transientes capacitivo aparecer e, em seguida, liberar qualquer aplicação de pressão. Dica: se a resistência de acesso (série) é alta (> 30MΩ), muitas vezes isso pode ser amenizada por outras, muito suave, os pulsos de pressão negativa.
7. Uma vez que um selo estável foi atingida aplicar um pulso de pressão negativa. Após o modo de toda a célula é obtido, permitem célula para se adaptar escuro por 5 minutos. Registro, no atual modo de fixação de resposta, para full-campo estímulo de luz branca (Figura 1B).
8. Após a gravação, Alexafluor-594 terá difundido para os dendritos. O marcador pode ser visualizado sob epifluorescência, em 594 nm e usado para determinar se um gânglio é On, Off, ou Bi-estratificada por alternar entre epifluorescência e DIC óptica infravermelha ^5.
9. Se neurobiotin está incluído na pipeta e retina vai ser processadas para imunohistoquímica, em seguida, pipeta deve ser cuidadosamente recolhido para proporcionar o mínimo de interrupção da membrana.

5) A análise da anatomia das células ganglionares gravado

Enchimento com neurobiotin permite uma análise mais detalhada morfológicas de células ganglionares da gravação. Dica: Se correlações específicas entre um gânglio gravado e morfologia detalhada é desejada, pode ser melhor para gravar e preencher apenas um RGC por preparação.

1. Se neurobiotin foi incluído na solução intracelular, em seguida, colocar a retina em solução paraformaldeído e corrigir durante a noite a 4 ° C.
2. Enxágüe em PBS, pelo menos duas horas, pelo menos 6 mudanças. Transferir a retina de um prato contendo solução de bloqueio. Deixe em solução de bloqueio por 2 horas, temperatura ambiente em agitador.
3. Substituir a solução de bloqueio com a solução de estreptavidina. Incubar por 2 dias a 4 ° C em shaker. Lavar a retina em PBS, 6 lavagens, 20 min cada.
4. Monte a retina com Vectashield em uma lâmina de vidro.A retina deve ser colocado com as células ganglionares para cima. Realizar microscopia confocal (Figura 1C).

Resultados representante

Se a retina é saudável e, a dissecção foi bem sucedida, as células ganglionares indivíduo deve ser visível sob DIC em grandes ampliações (Figura 1A). Retinas insalubres terá núcleos, grandes granulado e deve ser descartada. Se a resposta sináptica de uma dada célula ganglionar está intacta, então a célula deve responder no início da luz ou compensado com potenciais de ação e, no caso de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (Figura 1B), uma despolarização sustentada.

Figura 1. Localização, gravação e coloração de uma célula ganglionares da retina fluorescente etiquetado. (A) GFP RGC positiva visualizado sob iluminação de epifluorescência no aumento de 40 vezes (painel à esquerda) e sob iluminação DIC (painel direito). (B) a resposta de uma luz Synaptic células ganglionares da retina M2 intrinsecamente fotossensíveis registrados em todo o celular modo pinça de corrente de RGC fluorescente etiquetado. (C) M1 células ganglionares da retina intrinsecamente fotossensíveis que foi identificado sob epifluorescência, alvo de toda célula de gravação, cheia de neurobiotin, e então processadas para imunohistoquímica.

Discussão

Esta técnica é aplicável a qualquer gravações ganglionares da retina de células a partir de uma retina isolada. Embora na linha do rato usado acima intrinsecamente fotossensíveis, melanopsina expressando RGCs são rotulados com EGFP ^{2, 5,} este protocolo é facilmente transferível para outros fluorescente etiquetado linhas RGC ou pode ser generalizada para gravar a partir de RGCs selecionados aleatoriamente também. Esta técnica é particularmente valioso porque o arbor dendríticas de cada RGC e seus respectivos n...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Ames’	Sigma-Aldrich	A1420
Colagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hialuronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Bicarbonato de Sódio	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hidrazida	Invitrogen	A10442
Neurobiotina	Vector Laboratories	SP1120
Eletrodos	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Pinças	Fine Science Tools	11252-30
Tesoura Oftalmológica	Fine Science Tools	15000-00
Estreptavidina 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Soro de Cabra	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	19210