Entrega viral direcionada a neurônios corticoespinhais em um rato neonatal para estudar lesão medular

Resumo

Fonte: Smit, R. D., et al. Visando o trato corticoespinhal em ratos neonatais com um vetor viral duplo usando cirurgia combinada de cérebro e coluna. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a entrega direcionada de vetores virais aos neurônios corticoespinhais em um rato neonatal. O protocolo permite a expressão gênica precisa usando injeções virais anterógradas e retrógradas, facilitando a pesquisa sobre regeneração neural e plasticidade após lesão medular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeções diretas na medula espinhal visando os terminais do axônio

1. Usando a ponta da agulha de injeção de vidro, aproxime a linha média da medula espinhal identificando a artéria espinhal. No entanto, se a artéria espinhal estiver visivelmente descentralizada ou se desviar de alguma forma, aproxime a linha média usando a posição do processo espinhoso C2 e extrapolando-a ao longo da coluna.
   NOTA: Carregue o vírus no injetor pipetando ~ 5 μL em um pedaço de parafilme e posicione a agulha de forma que a ponta fique apoiada na gotícula do vírus.
2. Uma vez identificada, posicione a agulha logo posterior à lâmina C5 na linha média aproximada e use-a como ponto de referência. Em seguida, usando o micromanipulador, mova a agulha lateralmente para a direita em 0,3 mm. Abaixe a agulha até que ela toque a superfície da medula espinhal; A partir desta profundidade, mergulhe a agulha 0,6 mm na medula espinhal. Se necessário, continue a mergulhar a agulha até perfurar a medula espinhal; Em seguida, retraia ou abaixe a agulha até a profundidade apropriada.
3. Injete 1 μL de vírus retro-adeno-associado2-scCre a 250 nL / min. Após a conclusão da injeção, aguarde 2 minutos para que o vírus se difunda na medula espinhal antes de retirar lentamente a agulha. Repita as injeções usando as mesmas coordenadas laterais e de profundidade em mais dois locais dentro da janela espinhal, um no ponto médio e o final logo anterior à lâmina T1.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	Para limpar agulhas de vidro e carregar óleo vermelho em agulhas de vidro.
Instrumentos capilares de vidro	4878	precisão do mundo	dos tubos para agulhas de vidro puxadas - deve ser projetado para injetores do nanolitro.
Micromanipulador com escala de nônio	Kanetec	N/A	Para direcionamento preciso durante a cirurgia.
Instrumento Estereotáxico Padrão de Laboratório	Stoelting	51600	Para manter o suporte estereotáxico neonatal no lugar
Adaptador Padrão de Laboratório com Mouse & Neonatos	51615	Para fixação de crânio neonatal durante cirurgia craniana e injeções espinhais
Microscópio com Luz e Escala Vernier Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Usado para visualizar e medir o chanfro de tubos capilares de vidro puxados em agulhas de vidro funcionais.
Controlador de Bomba MicroSyringe	World Precision Instruments	62403	Para controlar a taxa de injeção.
Nanolitro 2000 Cabeça de Bomba Injetora	World Precision Instruments	500150	Para carregar e injetar vírus de forma controlada.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plasmídeo
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmídeo #44361)	Laboratório de Bryan Roth através	plasmídeo
Agulhas PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Para uso com as seringas de 1mL e 10 mL para permitir a injeção do modelo animal.
Fórceps de dente de rato	Roboz	RS-5152	Para processos espinhosos de gripe.
Solução salina estéril	Baxter Healthcare Corporation	281324	Para uso na limpeza do sangue e na reposição de fluidos pós-cirurgia.
Luvas cirúrgicas	N/A	N/A	Para uso pelo cirurgião para manter o campo estéril durante a cirurgia.
Almofada de aquecimento cirúrgica	N/A	N/A	Para manter a temperatura corporal do modelo animal durante a cirurgia.
Microscópio cirúrgico	N/A	N/A	Para uma melhor visualização da ferida cirúrgica.

da do Addgene DREADD