Implantação de uma Sonda Biocompatível Flexível em um Modelo de Camundongo com Glioblastoma

Resumo

Fonte: Lefevre, M. C., et al., Dispositivos Eletrônicos Orgânicos Flexíveis para Terapia de Campo Elétrico Pulsado de Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a implantação de uma sonda flexível e biocompatível em um modelo de camundongo com glioblastoma para fornecer terapia de campo elétrico pulsado direcionada para aplicações neuroterapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. O modelo in vivo
   NOTA: Camundongos AMU-Neuroinflam fluorescentes multicoloridos adultos (B6. Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) foram usados; esses camundongos apresentam marcação de uma subpopulação de neurônios Thy1⁺ pela expressão transgênica de ECFP, marcação de células inflamatórias periféricas LyzM⁺ pela expressão transgênica de EGFP e marcação de um subtipo de microglia expressando EYFP sob o controle de Cd11c⁺. Em resumo, os animais são levemente sedados com isoflurano a 1,5% por 2 minutos antes de qualquer tratamento ou injeção. Antes da cirurgia, os animais são anestesiados com cetamina (120 mg/kg; IP) e xilazina (12 mg/kg; IP). Em seguida, aplica-se localmente o gel de lidocaína a 3% para aliviar qualquer dor nos ouvidos associada à fixação do suporte estereotáxico. Em seguida, a solução de bupivacaína a 0,25% é administrada no local da cirurgia para aliviar qualquer dor devido à craniotomia. Uma vez que o camundongo foi preparado para a cirurgia, uma craniotomia de 4 mm de diâmetro foi realizada. Com uma agulha 26 G, foi feito um orifício na dura-máter no meio da craniotomia, e o esferóide tumoral foi injetado com o sistema de injeção. Além disso, conforme descrito aqui, um eletrodo flexível foi colocado no esferóide tumoral com expressão GCamp6 ou DsRed antes de selar a craniotomia com uma janela de vidro.
   1. Coloque uma gota de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) para cobrir a craniotomia. Coloque o eletrodo flexível na gota de DPBS e coloque suavemente a parte de trás da sonda com almofadas de contato na parte de trás do mouse (Figura 1B).
      NOTA: Use luvas estéreis e uma técnica de "apenas ponta". Troque as luvas se uma superfície não estéril for contatada. Forneça suporte térmico durante este procedimento.
   2. Toque a gota de DPBS com um pequeno pedaço de papel para absorver a DPBS até que a sonda possa ficar plana na dura-máter e seguir a curvatura do cérebro. Certifique-se de que uma pequena camada de DPBS permaneça abaixo dos eletrodos sem escapar da lateral do eletrodo. Isso garante uma barreira contra o derramamento de cola durante as próximas etapas.
      NOTA: Esterilize todos os equipamentos antes de usar.
   3. Coloque uma pequena gota de adesivo de silicone na sonda e cubra-a com uma lamínula redonda de 5 mm. Empurre a lamínula para baixo até que o silicone esteja uniformemente distribuído e a distância entre a lamínula e a sonda seja mínima. Empurre o vidro de cobertura para baixo por mais 30 segundos para que o silicone possa solidificar.
   4. Para prender a tampa de vidro, aplique rapidamente supercola nas laterais e empurre-a para baixo até que a cola cure e se torne sólida.
   5. Usando um palito de dente, aplique supercola no pescoço da sonda, tomando cuidado para que a supercola seja puxada sob o pescoço para fornecer um suporte estável para ela.
   6. Cubra o crânio com cimento dental para construir uma tampa crônica. Tome especial cuidado para cobrir apenas as bordas da tampa de vidro.
   7. Levante a parte de trás da sonda e aplique cimento embaixo do gargalo. Apoie a sonda no cimento antes de curar. Empurre suavemente o pescoço da sonda com uma pinça romba, de modo que sua superfície fique no mesmo nível da lamínula e não no caminho da objetiva do microscópio durante o experimento.
   8. Cubra a parte superior do pescoço da sonda com não mais de 1.5 mm de camada de cimento dentário para obter uma fixação firme na sonda. Construa um poço de cimento apresentando uma crista de 1,5 mm a uma distância de 1-2 mm ao redor da lamínula para criar uma bacia para o fluido de imersão para a imagem de dois fótons (Figura 1C).
   9. Após a cura do cimento, aplicar analgésicos pós-cirúrgicos com buprenorfina (0,05 mg/kg, 0,1 mL por 10 g de peso corporal por via subcutânea) e manter o animal em ambiente quente até que ele acorde. Isso inclui a proximidade de uma lâmpada infravermelha, bem como embrulhar o animal em uma toalha de papel.
      NOTA: Coloque um termômetro no nível do mouse para monitorar a temperatura.
   10. Caracterize a impedância na faixa de 1-10 kHz usando um potenciostato.
   11. Deixe o animal se recuperar da cirurgia por pelo menos 10 dias. Administre anti-inflamatórios imediatamente após a cirurgia e continue monitorando o estado do animal para fornecer analgesia pós-operatória adequada.

Resultados

Figura 1: O aplicativo in vivo. (A) Esquema para experimentos in vivo. (B) Colocação da sonda antes da aplicação da lamínula e da resina acrílica. (C) Implantação de sonda concluída.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Resina acrílica	Fischer scientific	NC1455685
Buprenorphine	Axience
Lab fez gerador
Penicilina / Estreptomicina	Gibco	15140-122
Tampão fosfato Solução salina	Thermofisher	D8537
Protolaser S	LPKF
Vidro de cobertura redonda 5 mm de diâmetro	Fischer scientific	50-949-439
Adesivo de silicone Kwik-Sil	World Precision Instruments
Células humanas super do	depósito

de pulsos glioblastoma do U87-MG ATCC HTB-14 do escritório da colagem