$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
- Preparando a seringa de microinjeção e o microinjetor para injeção:
- Trave cada seringa de microinjeção estanque ao gás no rack da bomba de microinjeção.
- Coloque a ponta da seringa estanque ao gás na água estéril contida em um pequeno barco de pesagem e agite suavemente o êmbolo para lubrificar o fio interno. Puxe uniformemente o êmbolo para o batente traseiro da bomba para enchê-lo com água.
- Deslize o tubo PE20 que está conectado ao microinjetor em uma agulha de 26 G (cubo marrom) conectada a uma seringa de 1 ml cheia de água estéril. Pulverize água estéril através do microinjetor e inspecione o padrão e a distância do spray.
NOTA: A água deve ser pulverizada muito longe e diretamente da ponta do microinjetor. Se o fluxo não for reto, o local de injeção não estará correto. - Coloque o microinjetor esterilizado em um campo estéril.
- Deslize o tubo para fora da agulha, mantendo o tubo do microinjetor na posição vertical para evitar que a água pingue enquanto também corta o tubo abaixo da área danificada pela agulha.
- Empurre o êmbolo da seringa de microinjeção ligeiramente para frente para criar uma gota na extremidade da agulha e deslize o tubo PE20 cheio de água (que está conectado ao microinjetor) na agulha.
NOTA: Isso criará uma conexão líquido-líquido que permitirá uma contrapressão apropriada que pode desalojar um entupimento que pode se formar na ponta do microinjetor. - Empurre o êmbolo completamente para frente para se preparar para o carregamento da amostra e certifique-se de que nenhum traço de etanol permaneça no microinjetor.
- Verifique se há vazamentos na configuração tocando a gota de água que se formou na ponta do microinjetor em um lenço limpo várias vezes.
- NOTA: Ao tocar no lenço umedecido, apenas uma mancha úmida deve se formar. Se houver mais quedas, há um vazamento no sistema.
- Evite vazamentos controlando a aplicação de super cola e aparando o tubo PE20 com uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear sempre que o tubo PE20 for removido de qualquer conexão.
- Puxe o êmbolo da seringa para trás 0,2 μl; criando uma bolha entre a água estéril no tubo/microinjetor PE20 e a solução a ser injetada.
- NOTA: Esta bolha evita a diluição do injetado, a contaminação da água e permite o monitoramento do processo de injeção, pois ele se moverá durante a injeção. Uma única bolha sólida deve ser produzida.
- Coloque o microinjetor no reagente a ser injetado e puxe lentamente o êmbolo da seringa para o batente traseiro.
- Preparando um animal para injeção:
- Segure o peito do rato contra o peito do experimentador. Limpe a área ao redor das cânulas com um aplicador de algodão embebido em etanol 70% (v/v).
- NOTA: Com o manuseio adequado, os ratos podem ser suavemente contidos com a mão em concha. Caso contrário, pode ser necessário scruffing.
- Remova os obturadores usando uma pequena pinça e coloque-os no barco de pesagem com etanol 70% (v/v).
- Realização de injeções:
- Coloque o microinjetor cheio na cânula. Pressione start na bomba de microinjeção e monitore o movimento da bolha.
- NOTA: Pode ser necessário aplicar uma leve pressão para garantir que os microinjetores não levantem. A bolha deve avançar uniformemente e entrar totalmente no microinjetor.
- Remova os microinjetores da cânula e substitua os obturadores, uma vez concluída a injeção e passado o período de difusão pós-injeção.
- NOTA: Os tempos típicos de difusão pós-injeção são de 2 a 4 minutos para reagentes farmacológicos e de 2 a 10 minutos para vírus. Deixar o microinjetor durante o período pós-infusão evita que o injetado reflua de volta para as cânulas em vez de se difundir no tecido. Coloque os obturadores na lateral do recipiente de pesagem cheio de etanol para permitir que o etanol seja drenado antes de reinserir na cânula.