Entrega baseada em microinjeção de um agente terapêutico em um cérebro de roedor acordado

Resumo

Fonte: Poland, R. et al. Microinjeção de cérebro de roedores para estudar substratos moleculares do comportamento motivado. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, uma configuração de microinjeção cheia de água que consiste em uma seringa e um tubo de microinjetor é usada para a administração precisa do medicamento. Um rato com uma cânula guia pré-implantada é submetido a microinjeção cerebral direcionada, permitindo a administração precisa de agentes terapêuticos em animais acordados com danos mínimos aos tecidos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparando a seringa de microinjeção e o microinjetor para injeção:
   1. Trave cada seringa de microinjeção estanque ao gás no rack da bomba de microinjeção.
   2. Coloque a ponta da seringa estanque ao gás na água estéril contida em um pequeno barco de pesagem e agite suavemente o êmbolo para lubrificar o fio interno. Puxe uniformemente o êmbolo para o batente traseiro da bomba para enchê-lo com água.
   3. Deslize o tubo PE20 que está conectado ao microinjetor em uma agulha de 26 G (cubo marrom) conectada a uma seringa de 1 ml cheia de água estéril. Pulverize água estéril através do microinjetor e inspecione o padrão e a distância do spray.
      NOTA: A água deve ser pulverizada muito longe e diretamente da ponta do microinjetor. Se o fluxo não for reto, o local de injeção não estará correto.
   4. Coloque o microinjetor esterilizado em um campo estéril.
   5. Deslize o tubo para fora da agulha, mantendo o tubo do microinjetor na posição vertical para evitar que a água pingue enquanto também corta o tubo abaixo da área danificada pela agulha.
   6. Empurre o êmbolo da seringa de microinjeção ligeiramente para frente para criar uma gota na extremidade da agulha e deslize o tubo PE20 cheio de água (que está conectado ao microinjetor) na agulha.
      NOTA: Isso criará uma conexão líquido-líquido que permitirá uma contrapressão apropriada que pode desalojar um entupimento que pode se formar na ponta do microinjetor.
   7. Empurre o êmbolo completamente para frente para se preparar para o carregamento da amostra e certifique-se de que nenhum traço de etanol permaneça no microinjetor.
   8. Verifique se há vazamentos na configuração tocando a gota de água que se formou na ponta do microinjetor em um lenço limpo várias vezes.
2. NOTA: Ao tocar no lenço umedecido, apenas uma mancha úmida deve se formar. Se houver mais quedas, há um vazamento no sistema.
3. Evite vazamentos controlando a aplicação de super cola e aparando o tubo PE20 com uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear sempre que o tubo PE20 for removido de qualquer conexão.
4. Puxe o êmbolo da seringa para trás 0,2 μl; criando uma bolha entre a água estéril no tubo/microinjetor PE20 e a solução a ser injetada.
5. NOTA: Esta bolha evita a diluição do injetado, a contaminação da água e permite o monitoramento do processo de injeção, pois ele se moverá durante a injeção. Uma única bolha sólida deve ser produzida.
6. Coloque o microinjetor no reagente a ser injetado e puxe lentamente o êmbolo da seringa para o batente traseiro.
7. Preparando um animal para injeção:
8. Segure o peito do rato contra o peito do experimentador. Limpe a área ao redor das cânulas com um aplicador de algodão embebido em etanol 70% (v/v).
9. NOTA: Com o manuseio adequado, os ratos podem ser suavemente contidos com a mão em concha. Caso contrário, pode ser necessário scruffing.
10. Remova os obturadores usando uma pequena pinça e coloque-os no barco de pesagem com etanol 70% (v/v).
11. Realização de injeções:
12. Coloque o microinjetor cheio na cânula. Pressione start na bomba de microinjeção e monitore o movimento da bolha.
13. NOTA: Pode ser necessário aplicar uma leve pressão para garantir que os microinjetores não levantem. A bolha deve avançar uniformemente e entrar totalmente no microinjetor.
14. Remova os microinjetores da cânula e substitua os obturadores, uma vez concluída a injeção e passado o período de difusão pós-injeção.
15. NOTA: Os tempos típicos de difusão pós-injeção são de 2 a 4 minutos para reagentes farmacológicos e de 2 a 10 minutos para vírus. Deixar o microinjetor durante o período pós-infusão evita que o injetado reflua de volta para as cânulas em vez de se difundir no tecido. Coloque os obturadores na lateral do recipiente de pesagem cheio de etanol para permitir que o etanol seja drenado antes de reinserir na cânula.

Materiais

< >< tabela classe = 'ck-table-resized'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'> Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários Tubo de cânulaAmazon Supply / Peças pequenasHTXX-26T-60calibre 26, Hipotubo S / S 316-TW 26GAObturadorAmazon Supply / Peças pequenasGWXX-0080-30-05calibre 33, Fio S / S 316LVM 0,008 INFio microinjetorMicroGroup33RW 30433 gaugeSuper ColaLoctite3924ACLíquido, Não-gel, pode ser autoclavadoMicroinjetor Tubo de PlásticoBecton Dickson427406PE20Hemostatos de Peso MédioWorld Precision Instruments501241-G RéguaFisher09-016150 mmFórcepsStoelting52100-77Dumont, Ferramenta Rotativa DumostarDremmel285Disco de Corte de Duas VelocidadesMcMaster Carr360215/16" x 0.025" Bomba de MicroinjeçãoHarvard ApparatusPhD 2000 1 ul Seringa de VidroHamilton7001KHEstilo da Agulha: 25s/2.75"/3Aplicador com Ponta de AlgodãoFisher23-400-101 Toalhetes de LaboratórioKimwipes34133 Software OperanteCoulbournGraphic State Operant ChambersCoulborunHabitest