Transplante de progenitores neuronais derivados de células-tronco em fatias corticais humanas

Resumo

Fonte: Palma-Tortosa, S., et.al. Culturas organotípicas do córtex humano adulto como um modelo ex vivo para transplante e validação de células-tronco humanas. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o transplante de células-tronco progenitoras neuronais derivadas de células-tronco em fatias de tecido cortical humano. O procedimento envolve isolar e ressuspender células progenitoras em uma matriz de membrana basal, seguida por sua injeção em uma fatia cortical colocada em um conjunto transwell. Após a incubação para permitir a solidificação da matriz e a diferenciação neuronal, o tecido transplantado é preparado para análise posterior.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Proliferação e diferenciação de células lt-NES

NOTA: células-tronco neuroepiteliais auto-renovadoras de longo prazo derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (lt-NES) são geradas e transduzidas com um vetor lentiviral que transporta proteína fluorescente verde (GFP) sob um promotor constitutivo (células GFP-lt-NES). Os frascos contendo 3 x 10⁶ células são armazenados a -150 ° C até o uso.

1. Preparação das soluções de estoque e mídia

1. Dilua 100 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) para obter uma concentração estoque de 10 μg / mL. Preparar alíquotas de 100 μL.

2. Diluir 100 μg de fator de crescimento epidérmico (EGF) em 10 mL de PBS-0,1% BSA para obter uma concentração estoque de 10 μg/mL. Preparar alíquotas de 100 μL.

3. Alíquota 50x suplemento B27 em um volume de 100 μL por alíquota.

4. Diluir 10 mg de poli-L-ornitina em 100 mL de água deionizada para obter uma concentração estoque de 100 μg/mL. Faça alíquotas de 1 mL.

5. Prepare alíquotas de 30 μL de 1,20 mg/mL de laminina de camundongo.

6. Diluir 10 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,25%) em 90 mL de PBS até uma concentração estoque de 0,025%. Prepare alíquotas de 1 mL.

7. Diluir 0,025 g de inibidor de tripsina em 50 mL de PBS até uma concentração estoque de 0,5 mg/mL. Prepare alíquotas de 1 mL.

8. Dilua 10 μg de Wnt3a (membro da família 3A do local de integração MMTV do tipo Wingless) em 1 mL de PBS-0,1% BSA para ter uma concentração de estoque de 10 μg/mL. Prepare BMP4 (proteína morfogenética óssea 4) da mesma maneira. Alíquota em um volume de 100 μL.

9. Diluir 1 mg de ciclopamina em 2,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) até uma concentração final de 400 μg/mL e fazer alíquotas de 100 μL.

10. Prepare o meio básico (Tabela 1) e o meio definido de diferenciação (DDM, Tabela 2) e armazene a 4 °C por até 2 semanas.

2. Revestimento de placas de cultura

1. Para pré-revestir as placas para cultivar as células GFP-It-NES durante a proliferação ou diferenciação, diluir a poli-L-ornitina 1:100 em água desionizada e adicionar 5 mL da solução a um balão T25. Incube durante a noite em temperatura ambiente (RT).

2. Lave as placas revestidas com poli-L-ornitina 1x com água deionizada e 1x com PBS.

3. Para células GFP-It-NES em proliferação, diluir a laminina de camundongo a 1:500 em PBS e incubar por pelo menos 2 h a 37 °C. Para células GFP-It-NES em diferenciação, diluir a laminina de camundongo a 1:100 em PBS e incubar por pelo menos 2 h a 37 ° C.

3. Proliferação das células GFP-lt-NES

1. Aqueça 5 mL (para lavagem) e 5 mL (para semeadura) de meio básico em dois tubos diferentes de 15 mL.

2. Descongele rapidamente um frasco de células GFP-lt-NES a 37 °C, transfira-as para o tubo de lavagem e centrifugue a 300 x g por 5 min.

3. Aspire o meio cuidadosamente sem tocar no pellet e ressuspenda as células em 1 mL de meio básico pré-aquecido. Transferir a suspensão celular para o tubo de semeadura contendo meio básico suplementado com fatores de proliferação: EGF (10 ng/mL), bFGF (10 ng/mL) e B27 (10 ng/mL). Semear as células num balão T25 revestido com poli-L-ornitina/laminina.

4. Alimente as células com fatores de proliferação todos os dias. Substitua o meio se ficar amarelo. Passe as células a cada três ou quatro dias (1 dia após atingirem 100% de confluência).

4. Dividindo as células GFP-lt-NES para proliferação e diferenciação

1. Pré-aqueça 5 mL de meio básico por frasco (para coletar as células), mais o volume total necessário para replantá-las.
NOTA: A passagem é feita em uma diluição de 1:3 para manter as células em proliferação, exigindo 15 mL de meio básico, e uma diluição de 1:6 para iniciar a diferenciação, exigindo 30 mL de meio básico.

2. Remova o meio do frasco de cultura de células por aspiração e adicione 500 μL de tripsina a 0,025% pré-aquecida. Incube por 5-10 min em RT. O descolamento das células pode ser confirmado sob um microscópio óptico padrão com ampliação de 10x.

3. Adicione um volume igual de inibidor de tripsina (concentração final de 0,5 mg/mL) seguido de 5 mL de meio básico quente. Retire e colete as células pipetando suavemente para cima e para baixo. Transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 300 x g.

4. Para manter as células em proliferação, replaquear em uma diluição de 1:3 em meio básico fresco suplementado com fatores de proliferação e repetir a etapa 1.3.4.

5. Diferenciação cortical das células GFP-lt-NES

1. No dia 0, ressuspenda as células (a serem usadas para diferenciação) em 30 mL de meio básico suplementado com fatores de proliferação e coloque-as em seis frascos T25 revestidos com diferenciação (divisão 1:6).

2. No dia 1, troque metade do meio para DDM e adicione fatores de proliferação na metade de sua concentração.

3. No dia 2, mude completamente o meio para DDM complementado com fatores de diferenciação: BMP4 (10 ng/mL), Wnt3a (10 ng/mL) e ciclopamina (400 ng/mL).

4. No dia 4, adicione apenas os fatores de diferenciação. Substitua o meio se ficar amarelo.

5. No dia 6, altere o meio para DDM complementado com BMP4 e Wnt3a. A ciclopamina é removida nesta etapa.

6. No dia 7, desconecte as células conforme indicado na etapa 1.4.2 e na etapa 1.4.3.

2. Transplante das células GFP-lt-NES em fatias organotípicas de hACtx

NOTA: O tecido cortical humano adulto (hACtx) deve ser cultivado por 1 semana antes do transplante de células. Para facilitar o procedimento de transplante, é necessário remover 2 mL do meio hACtx da parte superior da inserção para evitar que o tecido flutue.

1. Ressuspenda as células GFP-lt-NES corticalmente preparadas (da etapa 1.5.6) em matriz de membrana basal pura fria (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração de 1 x 105 células / μL e transfira a solução para um tubo estéril menor.

NOTA: Durante o procedimento de transplante, todos os materiais (pontas de pipeta, tubos, capilares, etc.) devem ser pré-resfriados para evitar a solidificação do gel. Descongele o gel da matriz da membrana basal no gelo por 30 min antes de usá-lo.

2. Recolha a suspensão celular em um capilar de vidro frio conectado a uma tetina de borracha para sucção. Injete a suspensão celular como pequenas gotas (aprox. 1 μL cada) esfaqueando a fatia de tecido semi-seco em vários locais.

3. Incube a 37 °C por 30 min para que o gel solidifique. Transfira a placa da incubadora de volta para o exaustor e adicione cuidadosamente 2 mL de meio hACtx na parte superior da inserção para submergir completamente o tecido.

4. Substitua o meio de cultura por meio hACtx fresco uma vez por semana.

Resultados

Tabela 1: Composição do meio de proliferação das células lt-NES (meio básico).

Basic Medium	Stock concentração	Concentração final	Por 100 mL
DMEM/F12 com L-Glutamina	1x		98,7 mL

...

Materiais

GERAÇÃO DE células lt-NES

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL
TISSUE Placa de 6 poços	ThermoFisher Scientific	140675
Alvetex scaffold 6 well insert	Reinnervate Ltd	AVP004-96
Suplemento B27 (50x)	ThermoFisher Scientific	17504001
BrainPhys sem tecnologias de	células-tronco	#05791	Referenciado como meio neuronal no texto
Unidades de filtro 250 mL ou 500 mL	Corning Sigma	CLS431096/97
Fórceps	Qualquer
(50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	15750037
Glutamax Suplemento (100x)	ThermoFisher Scientific	35050061	Referenciado como L-glutamina no texto
Tetina de borracha + pipeta de vidro	colspan
2-Mercaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Scientific
Animal Free Recombinante EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 Suplemment (50x)	Thermo Fisher Scientific	17504001
bFGF	Peprotech	AF-100-18B
Fração de Albumina Bovina V (solução a 7,5%)	ThermoFisher Scientific	15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum	Calbiochem	# 239803
D (+) Solução de glicose (45%)	Sigma	G8769
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma Aldrich	D2438-10mL
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144	Sem proteína
camundongo de laminina de cálcio e magnésio, soluções naturais	Thermo Fisher Scientific	23017015
MEM (100x)	11140050		ThermoFisher Scientific
(100 x)	ThermoFisher Scientific	17502001
Poli-L-Ornitina	Merk	P3655
Sistemas de P&D de Proteína BMP-4 Humana Recombinante		314-BP-010
Sistemas de P&D	de Proteína Wnt-3a Humana Recombinante	5036-WN
Piruvato de Sódio (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
Inibidor de Tripsina de Soja, pó	Thermo Fisher Scientific	17075029
Água	deionizada estérilSistema	de filtro MilliQ
MilliQ Tripsina EDTA (0,25%)	Sigma	T4049-500ML
EQUIPAMENTO PARA CULTURA DE CÉLULAS
Pipetas de volume ajustável 10, 100, 200, 1000 μL	Eppendorf	Várias
matrizes de membrana basal qualificadas por ESC (Matrigel)	Corning	CLS354277-1EA
Centrífuga	Hettich Centrifugen	Rotina 420R	5% CO2, 37 °C
Incubadora	ThermoForma Steri-Cult CO2	HEPA Class100
Ferramenta de corte de células estaminais 0,190-0,210 mm	Vitrolife	14601
Tubos estéreis	Sarstedt	Várias
pipetas de vidro descartáveis estéreis Pasteur 150 mm	VWR	612-1701
Ponteiras de pipeta estéreis 0,1-1000 μL	Biotix VWR	Várias
pipetas serológicas estéreis 5, 10, 25, 50 mL	Costar	Vários
frascos T25 Nunc	ThermoFisher Scientific	156367

vermelhas de fenol gentamicina adequada Qualquer ='4' rowspan='1'>31350010 de de aminoácidos não essenciais Suplemento N-2 da