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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Cirurgia de estimulação cerebral profunda (DBS)
- Injete a mistura de cetamina / xilazina por via intraperitoneal no animal e confirme se ele atingiu um plano cirúrgico de anestesia (verificando o reflexo de pinça do dedo do pé, a profundidade da frequência respiratória e a regularidade da respiração). Remova o cabelo da região do couro cabeludo que será incisada e desinfete o couro cabeludo com três esfoliações alternadas, cada uma de betadine e álcool ou solução salina estéril. Prenda e posicione o animal na estrutura estereotáxica.
- Use almofadas de água morna circulantes para manter a temperatura corporal do animal em um nível ideal. Aplique lubrificante ocular para proteger os olhos do animal do ressecamento excessivo.
- Use as seguintes coordenadas estereotáxicas para direcionar o ATN (núcleo talâmico anterior): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm e dorsoventral 5,2 mm.Faça uma incisão no couro cabeludo sagitalmente para revelar o crânio. Usando um par de afastadores, prenda o couro cabeludo inciso para expor o crânio. Use solução salina estéril para lavar a incisão. Se a incisão estiver muito molhada, use cotonetes estéreis para secá-la. Localize o bregma e marque-o com um marcador preto. Para guiar a posição dos orifícios da broca, faça mais duas marcas a aproximadamente 1,5 mm mediolateralmente em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 mm posterior à sutura coronal.
- Use uma furadeira manual para fazer os furos de rebarba. Certifique-se de que a ponta do orifício da rebarba esteja estéril, esterilizando-a com etanol. Segure a broca em um ângulo de cerca de 45° em relação à superfície do crânio durante a perfuração. Alterne frequentemente entre os dois orifícios de rebarbas para evitar calor excessivo no local de qualquer orifício de rebarba.
- Continue perfurando até que a dura-máter fique exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada semelhante à forma de um 'L', remova quaisquer pedaços quebrados de osso que obstruam a inserção do eletrodo. Tome cuidado para evitar danificar a dura-máter e/ou o tecido cerebral subjacentes ao remover fragmentos ósseos usando a agulha dobrada.
NOTA: Usar uma agulha cega ou uma pinça fina e romba também é uma opção. - Fixe o conjunto de eletrodo duplo na alça giratória da estrutura estereotáxica e fixe a alça em um ângulo de 90°. Usando os ajustes no quadro estereotáxico, posicione o eletrodo esquerdo exatamente acima do bregma.
- Usando os ajustes estereotáxicos para o posicionamento mediolateral, mova com precisão o eletrodo esquerdo 1,5 mm para o lado esquerdo do bregma para que agora haja dois eletrodos perfeitamente alinhados ao longo da sutura coronal, mas espaçados 1,5 mm mediolateralmente do bregma.
- Usando os ajustes estereotáxicos anteroposteriores, mova os eletrodos 1,6 mm posteriormente à sutura coronal.
- Use os ajustes dorsoventrais para abaixar os eletrodos para verificar primeiro se os orifícios das rebarbas foram feitos no local correto, de modo que os eletrodos possam ser inseridos com facilidade, sem tocar nas bordas ásperas dos orifícios das rebarbas. Em caso afirmativo, insira os eletrodos a uma profundidade de 5.2 mm da superfície do crânio.
- Conecte os eletrodos por meio de fios a um estimulador ajustado para largura de pulso de 130 Hz, 2.5 V e 90 μseg.
- Forneça estimulação de alta frequência por uma hora (ou por um período de tempo desejado, de acordo com a configuração experimental). Durante o curso da simulação, lembre-se de garantir a profundidade anestésica adequada regularmente, verificando a ausência de retirada do pé em resposta a um beliscão do dedo do pé. Complemente a anestesia com aproximadamente metade da dose inicial usada para induzir a anestesia. Evite a contaminação de suas luvas estéreis ao verificar a profundidade do anestésico e troque-as, se necessário. Realize estimulação unilateral ou bilateral com base nas necessidades experimentais de cada um. Inclua controles como estimulação de baixa frequência (por exemplo, 10 Hz) e animais não estimulados (inserção de eletrodos sem estimulação subsequente).