Injeção estereotáxica de vírus para modificação genética estável em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Porlan, E., et al. Modificação genética estável e eficiente de células no camundongo adulto V-SVZ para a análise de efeitos autônomos e não autônomos de células-tronco neurais. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a modificação genética estável de células-tronco neurais (NSCs) na zona ventricular-subventricular (V-SVZ) por meio da injeção estereotáxica de um gene terapêutico portador de vírus em um modelo de camundongo. O vírus entra nas NSCs, sofre transcrição reversa, integra-se ao genoma e permite modificação genética estável e eficiente para aplicações neuroterapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção Estereotáxica de Ventrículo Lateral (VE) na Zona Ventricular-Subventricular (V-SVZ)/Borda do Estriado ou no VE

1. Microinjeção de LV
   1. Selecione e esterilize as ferramentas necessárias para a cirurgia (bisturi, broca e pinças pequenas).
   2. Anestesiar um camundongo de 6 a 8 semanas injetando intraperitonealmente (ip) uma mistura supervisionada por veterinário de cetamina e medetomidina. Pesar cada animal e dosar cada um com 50-75 mg de cetamina e 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal do camundongo (cerca de 100-125 μl da solução de trabalho de cetamina / medetomidina por camundongo).
   3. Avalie o plano anestésico beliscando os dedos dos pés, cauda ou orelha e garantindo que o animal não apresente nenhuma reação.
   4. Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, injete butorfanol por via subcutânea em uma dose final de 0,4-0,5 mg por kg de peso do camundongo para minimizar a dor pós-cirúrgica.
   5. Raspe a área entre as orelhas e desinfete a pele usando um iodóforo como iodopovidona ou etanol 70%. Limpe usando aplicadores estéreis com ponta de algodão. Tenha cuidado para não molhar excessivamente o animal, pois isso pode exacerbar a hipotermia.
   6. Coloque o animal em decúbito ventral em uma estrutura estereotáxica e fixe cuidadosamente a cabeça usando as barras auriculares e o suporte do palato do aparelho. Mantenha o mouse com uma almofada de aquecimento ajustada a 37 °C e aplique lubrificante oftálmico nos olhos.
   7. Faça uma incisão de 1 cm de comprimento na pele da cabeça longitudinalmente usando um bisturi e retraia suavemente a pele para expor o crânio usando uma pinça fina.
   8. Limpe cuidadosamente a superfície óssea com um aplicador estéril com ponta de algodão. Limpe o osso do crânio exposto de qualquer tecido remanescente.
   9. Monte a seringa esterilizada no dispositivo estereotáxico usando o suporte da seringa.
   10. Mova o porta-seringa ao longo dos eixos x, y e z até que a ponta da agulha da seringa esteja posicionada no bregma, o ponto de conjunção onde a sutura sagital (longitudinal e medial) é perpendicularmente interceptada pela sutura coronal (Figura 1b). Certifique-se de que a posição "zero" do eixo dorso-ventral (DV) esteja na superfície do crânio na bregma.
   11. Mova a seringa para as coordenadas de destino x e y (ver Tabela 1 e Figura 1b).
   12. Anote as coordenadas de destino x, y e z na escala Vernier para poder voltar ao local da injeção mais tarde. Marque o osso nas coordenadas x e y usando um marcador cirúrgico.
   13. Afaste a seringa da área de trabalho.
   14. Usando uma furadeira elétrica, faça um furo no crânio com cuidado para não danificar o cérebro. Não perfure a superfície pial, pois isso pode danificar a superfície do cérebro.
   15. Carregue a seringa com 1 μl da solução viral 10⁶ TU/μl (unidades de transdução por microlitro). Use uma agulha chanfrada afiada de calibre 33 cuja ponta tenha um ângulo de 10-12°. Posicione a agulha da seringa em um ângulo de 90° em relação à superfície do cérebro.
   16. Mova a seringa de volta para o local da injeção e mova-a para baixo até que a ponta toque a superfície pial.
   17. Penetre no cérebro com a seringa até a coordenada z no eixo DV.
   18. Libere lentamente a suspensão viral a uma taxa de 0,2 μl/min para minimizar os danos ao tecido cerebral devido à pressão excessiva do fluido.
   19. Aguarde 5-10 minutos para minimizar o refluxo da suspensão viral e, em seguida, retraia a seringa muito lentamente.

Região de injeção	Coordenadas
	Ântero-posterior (AP	)Médio-lateral (ML)	Dorso-ventral (DV)
SEZ/borda estriada	+0,6 mm	+1,2	mm-3,0 mm
Ventrículo	lateral-0,3 mm	+1,0	mm-2,6 mm<

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Tabela 1: Coordenadas estereotáxicas para as injeções. Para os eixos ântero-posterior (AP) e médio-lateral (ML), as coordenadas x e y são dadas como uma distância (em mm) do bregma. "-" indica "em direção a posterior". Para as coordenadas DV, "zero" é a superfície do crânio no ponto de bregma, e as coordenadas DV indicam a distância (em mm) a partir deste ponto.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática das diferentes partes do procedimento. (a) Geração de LVs para estudos de marcação in vivo, desde a transfecção de células 293T (HEK293T) do rim embrionário humano com plasmídeos apropriados para gerar os LVs, até a det...

Materiais

Equipamento:

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vernier instrumento estereotáxico	NeuroLab, Leica	39463001
Suporte de seringa	KD Scientific	KDS-311-CE 33-gauge
seringa	Hamilton	P/N 84851/00	85RN
Furadeira elétrica	Fine Science Tool	98096
Manta térmica	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, tipo C-AL01
Barbeador	Jata	MP373N	Modelo: beauty, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.
Reagentes:
Medetomidina	Esteve	Domtor	Comercial solução a 1 mg/ml.
Cetamina	Merial	Imalgene 500	Solução comercial a 50 mg/ml
		medetomidina/cetamina	Prepare uma mistura de trabalho de medetomidina a uma concentração final de 0,2 mg/ml de diluição e cetamina a uma concentração final de 15 mg/ml em solução salina. Use como anestesia injetando um volume para obter uma concentração final de 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal e 50-75 mg de cetamina por kg de peso corporal
Butorfanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution a 10 mg / ml. Usado como analgesia a 1 mg / ml em solução salina.
Solução salina a 0,9%	Braun	13465412
Caneta marcadora cirúrgica	Staedler	313-9	Lumocolor permanente
Lubrificante		Siccafluid	0,5 g/dose, carbômero 974P
Iodopovidona	Betadine	694109,6	10% iodopovidona

<td colspan='4' rowspan='1'>Mistura de oftálmico