Manipulação de células de placas neurais por meio de nanoinjeção in utero em um modelo de camundongo embrionário

Resumo

Fonte: Mangold, K., H el. al., Direcionamento de placa neural murina por nanoinjeção in utero (NEPTUNE) no dia embrionário 7.5. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o método de nanoinjeção no útero para direcionamento de placas neurais em um modelo de camundongo embrionário. Uma solução lentiviral de alto título é injetada na cavidade amniótica, onde se integra às células da placa neural, permitindo a manipulação estável de genes para pesquisas de neurodesenvolvimento e aplicações terapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeções

NOTA: Todos os instrumentos usados neste procedimento são esterilizados antes da cirurgia e entre cada camundongo.

1. Anestesie a primeira fêmea com cáries de tamanho ideal.
2. Coloque e fixe a fêmea na mesa.
3. Aplique gel ocular nos olhos para evitar a dessecação da córnea e injete analgésicos por via subcutânea.
   NOTA: Analgésicos recomendados: Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) ou Flunixina (2,5 mg/kg) ou similar, de acordo com os regulamentos locais de bem-estar animal. A analgesia perioperatória multimodal é mantida com analgésicos injetados e isoflurano.
4. Prepare assepticamente a parte inferior do abdômen limpando com um pano embebido em solução de clorexidina 0,5 mg/mL (ou similar) e seque a pele. Use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão vertical na linha média de 1,5-2,0 cm na parte inferior do abdômen.
   NOTA: Prepare a área cirúrgica seguindo as rotinas de desinfecção aprovadas localmente.
5. Levante a pele suavemente e liberte a pele da camada muscular subjacente, aproximadamente 1 cm ao redor do ponto de incisão, para facilitar a sutura após a cirurgia.
6. Faça uma incisão vertical na linha média de 1 cm na camada muscular.
7. Com uma pinça, levante um lado da pele e da camada muscular e, com o outro par, procure os cornos uterinos.
   NOTA: Os decidudas são dispostos como contas em um colar, enquanto o intestino é um tubo longo e contínuo (Figura 1A).
8. Com uma pinça, retire cuidadosamente os dois chifres uterinos do abdômen. Segure o tecido entre os embriões; não os aperte diretamente (Figura 1B).
   NOTA: O útero está preso ao corpo no colo do útero e os dois ovários/ovidutos estão presos por meio de ligamentos. Não puxe/retire o útero desses pontos de ancoragem.
9. Conte e anote o número de embriões nos lados esquerdo e direito.
10. Numere os embriões do ovário ao colo do útero ou do colo do útero ao ovário.
    NOTA: Isso é especialmente importante se os embriões injetados forem coletados em estágios embrionários.
11. Com um cotonete úmido, empurre suavemente todos os embriões de volta para a cavidade abdominal, exceto os três primeiros a serem injetados.
12. Coloque uma gota de PBS (solução salina tamponada com fosfato) no elástico da placa de Petri e segure-a imediatamente acima dos embriões.
13. Insira uma pinça fechada na incisão do elástico e solte a pinça para abrir a incisão elástica para que o líquido caia sobre os embriões.
    NOTA: Isso garante a reidratação dos embriões e que a membrana elástica adira à pele molhada da fêmea, evitando o vazamento de PBS nas próximas etapas.
14. Puxe uma seção do útero, correspondente a três embriões, através do elástico com uma pinça e empoleire suavemente a placa de Petri no abdômen da fêmea.
15. Com a pinça e um cotonete úmido, ajuste o posicionamento do útero e o elástico para garantir que o elástico seja selado à pele da mulher para evitar vazamento de PBS.
16. Use os quatro pés de argila para prender e prender a placa de Petri imediatamente acima do abdômen, reduzindo a pressão sobre a fêmea e a sensibilidade da imagem à respiração e aos batimentos cardíacos da fêmea.
17. Pressione o cilindro de massa de modelar para baixo à direita dos embriões/útero para fixar o útero (Figura 1C).
    NOTA: Esta instrução de orientação pressupõe que a agulha está à esquerda da fêmea e que os embriões do corno uterino esquerdo da fêmea estão expostos. O lado do útero (corno uterino esquerdo ou direito) é crucial, pois o amniótico (AC) está voltado para a agulha (chifre esquerdo; Figura 1D) ou enfrenta o cilindro de argila estabilizador (chifre direito; Figura 1E).
18. Para injetar embriões do corno uterino direito, coloque o cilindro de argila no lado esquerdo dos embriões (Figura 1F) e gire a mesa de aquecimento 180° (Figura 1G) para obter a orientação correta. Se a agulha puder ser movida, adapte-se conforme apropriado para a configuração relevante.
19. Adicione PBS à placa de Petri até que os embriões e o útero estejam cobertos com PBS.
20. Abaixe a sonda de ultrassom no PBS e ajuste o mouse/mesa cirúrgica para que o primeiro embrião fique alinhado com a sonda de ultrassom para facilitar o registro das injeções.
    NOTA: "Primeiro" refere-se à numeração de embriões do ovário ao colo do útero.
21. Examine todos os três embriões e inspecione os ACs. Determine o volume de injeção da seguinte forma:
    1. Meça o diâmetro da CA com a máquina de ultrassom. Injete 69 nL se o diâmetro CA for ≤0,2 mm; injectar 2 x 69 nL (= 138 nL) se o diâmetro CA for >0,2 mm e ≤0,29 mm; e injetar 3 x 69 nL (= 207 nL) se o diâmetro CA > 0,29 mm (Figura 1H).
       >NOTA: Experimentos anteriores mostraram que até 207 nL volumes de injeção são bem tolerados em E7,5. Injeções bem-sucedidas com impacto mínimo na sobrevida são alcançadas quando o aumento do volume relativo da CA não excede 90%. A variação no tamanho da CA entre irmãos de ninhada ou linhagens de camundongos é comum e pode exigir mais otimização.
22. Defina os volumes de injeção com o controlador de injeção.
23. Defina a velocidade de injeção para lenta com uma taxa de injeção de 23 nL/s.
    NOTA: Diferentes modelos de equipamento podem resultar em diferentes forças de injeção.
24. Abaixe a agulha no PBS usando as rodas principais do sistema de trilhos (planos x e z, Figura 1I) e pressione Esvaziar no controlador do nanoinjetor até que o líquido atinja a ponta da agulha.
    NOTA: Se a agulha estiver entupida, pressionar Esvaziar pode dissolver o entupimento e/ou expelir o entupimento.
25. Levante a agulha do PBS e pressione Injetar. Verifique se uma gota do volume desejado aproximado foi descarregada.
26. Abaixe a agulha no PBS e alinhe-a com a sonda de ultrassom e o embrião movendo o nanoinjetor com a roda do plano y no micromanipulador (Figura 1J).
    NOTA: A ponta da agulha está perfeitamente alinhada quando aparece como um ponto brilhante na imagem de ultrassom (Figura 1K,L). A agulha pode ser movida em todos os três planos de direção com o micromanipulador.
27. Ajuste o ângulo da agulha com a roda do ângulo de injeção para garantir um ângulo de injeção quase perpendicular em relação à parede uterina. Insira a agulha na CA em um movimento usando a roda de injeção no micromanipulador (Figura 1J-M). Fique de olho no brilho da ponta da agulha. Se a ponta da agulha desaparecer da imagem de ultrassom, mova a sonda de ultrassom para frente ou para trás para trazer a agulha de volta ao foco.
    NOTA: Uma vez que a agulha esteja dentro da CA, pequenas modificações na posição e no foco da agulha podem ser feitas sem prejudicar o embrião (ajustes dentro de ~0,3 mm). Não ajuste a posição da agulha mais do que isso.
28. Pressione Injetar (para 207 nL, ajuste o volume para 69 nL e injete três vezes). Após a injeção, aguarde mais 5-10 s antes de retrair a agulha em um movimento suave.
29. Mova o estágio para o próximo embrião e repita as etapas 1.22-1.26 para os outros dois embriões se eles tiverem tamanhos AC adequados.
30. Levante a sonda de ultrassom e a agulha do PBS usando o micromanipulador. Afaste a agulha do operador para evitar danos e ferimentos.
31. Com uma pinça, direcione o 1º e o 2º embriões de volta para o abdômen da fêmea, empurrando-os suavemente através do elástico. Segure suavemente o tecido adjacente ao 3º embrião e puxe o útero em direção à extremidade superior da incisão elástica. Puxe suavemente os 4º-6º embriões com uma pinça e permita que o 3º embrião entre novamente no abdômen.
    NOTA: Esta etapa pode ser feita sem alterar o PBS ou remover a placa de Petri.
32. Repita conforme necessário até que todos os embriões com ACs ideais tenham sido injetados ou o limite de tempo tenha sido atingido.
33. Empurre suavemente os embriões/útero de volta para o abdômen da fêmea.
34. Aspirar o PBS e retirar a placa de Petri. Se um vírus foi usado, trate-o como lixo infeccioso.
35. Costure a camada muscular com Vicryl (USP 6-0, comprimento da agulha 13 mm, 3/8 Circle) em suturas simples contínuas ou interrompidas e feche a pele com 1-2 clipes (consulte a Tabela de Materiais).
36. Desligue a bomba de isoflurano.
37. Remova a fita cirúrgica e coloque a fêmea em decúbito ventral (barriga para baixo) em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento a 40 °C.
    NOTA: Espera-se que a fêmea recupere a consciência e se mova em 10 minutos. Certifique-se de que o procedimento seja concluído em 30 minutos. O histórico genético, a idade e o peso da mulher podem influenciar a sensibilidade à anestesia. Monitore os camundongos durante a cirurgia em busca de sinais de respiração lenta (respiração lenta significa que a anestesia é muito profunda) ou movimento (a anestesia é muito leve). Buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de peso corporal) ou Flunixina (2,5 mg/kg) ou similar, de acordo com os regulamentos locais de bem-estar animal, podem ser fornecidos 8 horas após a primeira injeção, se necessário.
38. Se outra fêmea for injetada, prepare a área cirúrgica enquanto monitora o despertar da primeira.
    1. Limpe as ferramentas cirúrgicas com etanol a 70% para remover qualquer resíduo de sangue ou tecido e esterilize-as no esterilizador de esferas de vidro pré-aquecido por 10 s. Descarte os cotonetes e use papel de seda. Limpe a placa de Petri e os pedaços de argila com papel de seda.
39. Repita os passos 1.1-1.35 até que todas as fêmeas tenham sido injetadas.
40. Esvazie e descarte a agulha.
    1. Se houver um vírus ou solução injetável na agulha, pressione Esvaziar no nanoinjetor e esvazie o conteúdo da agulha em papel de seda.
    2. Retraia o êmbolo de metal completamente pressionando Fill até que haja um bipe duplo do controlador, o que indica que o êmbolo está completamente retraído.
    3. Afrouxe a pinça e deslize a agulha para fora do êmbolo de metal. Descarte a agulha no recipiente de resíduos perfurocortantes.
41. Limpe a bancada BSL-2 (Nível de Biossegurança 2).
    1. Se um vírus foi usado, borrife todo o campo cirúrgico com desinfetante (consulte a Tabela de Materiais). Após 15 min, limpe o desinfetante e limpe todo o campo cirúrgico com etanol a 70%. Se nenhum vírus foi usado, limpe todas as superfícies com etanol a 70%.
    2. Limpe qualquer PBS restante da sonda de ultrassom com papel de seda seco, macio e sem fiapos.
42. Descarte os resíduos de acordo com as diretrizes de biossegurança.
43. Desligue a máquina de ultrassom, a mesa de aquecimento, a bancada BSL2 e a alimentação de O₂.

Resultados

Figura 1: Tamanho e orientação ideais da cavidade amniótica para injeções bem-sucedidas. (UMA) Corno uterino com múltiplas decíduas E7.5, em forma de um colar de esferas (parte inferior) em comparação com o intestino grosso (p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL Seringa	BD Bioscience	309628
27 G Agulha	BD Bioscience	300635
3.5 polegadas capilares	Drummond Scientific	3000203G/X	Foram usados para puxar agulhas domésticas
Transdutor da série MS de 70 MHz	Visual Sonics	MS700
Aquasonic gel de ultrassom transparente	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
Camundongos CD1	Charles River, Alemanha	Crl:CD1(ICR)	Fêmeas: a partir das 8 semanas de idadeMachos: a partir das 12 semanas de idade
Cotonete	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Pinça de curativo delicada reta 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	Clips
Iris Tesoura, Super Cut, reta, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorano	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Comprado na Farmácia Sueca
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Fita de Membrana	Visual Sonics	SA-11053
Extrator de Micropipeta	Instrumento Sutter	P-97
Modelagem Clay	Sense AB	10209
Mesa de Manuseio de Mouse	Visual Sonics	50249
Kit Injetor Automático Nanoject II	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C placa de
Petri com abertura central (parede baixa)	Visual Sonics	SA-11620
Placa de Petri, (ØxA): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	Desinfetante 130000132037
Membrana de silicone	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, esterilizador de esferas quentes	Fita Cirúrgica Angthos	31100
(1,25 cm x 9,14 m)	Sistema de Anestesia Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2)	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Estação de Imagem 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; Agulha C-3, filamento roxo de 45 cm	Agnthos	J384H