Transferência de genes para células de Schwann do nervo ciático de roedores via eletroporação

Resumo

Fonte: Ino, D. et. al., Transferência de genes in vivo para células de Schwann no nervo ciático de roedores por eletroporação. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a transferência de genes in vivo para as células de Schwann do nervo ciático de roedores usando eletroporação. Uma solução de corante de DNA de plasmídeo é injetada no nervo e pulsos elétricos facilitam a entrada de DNA. O DNA mais tarde se integra ao genoma da célula, permitindo a transferência bem-sucedida de genes nas células de Schwann.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de DNA de plasmídeo

1. Gere plasmídeos de DNA para eletroporação in vivo subclonando o DNA complementar (cDNA) ou a sequência de RNA de grampo curto (shRNA) em um plasmídeo de expressão para células de mamíferos. Use um intensificador precoce imediato de citomegalovírus e um plasmídeo acionado por promotor de fusão do promotor de β-actina (CAG) de galinha porque permite uma expressão forte e estável. Para a expressão de shRNAs sob o controle de um promotor CAG, use um sistema de de shRNA baseado em mir30 para subclonar o shRNA.
2. Purifique o DNA do plasmídeo com um kit de maxi-prep de acordo com as instruções do fabricante e ressuspenda o DNA com solução salina tamponada com HEPES (cloreto de sódio 140 mM, NaCl, hidrogenofosfato dissódico 0,75 mM, Na₂HPO₄, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico 25 mM (HEPES); pH 7,40). Ajustar a concentração de ADN para ≥4 μg/μl.
3. Preparar a solução de ADN plasmidial para uma concentração de 4 μg/μl e adicionar uma quantidade mínima de corante verde rápido (concentração final de 0,01%) para marcar o local de injecção. Quando a eletroporação simultânea de vários plasmídeos for necessária, ajuste a concentração total da solução de DNA do plasmídeo para 4 μg/μl.
   NOTA: A composição ideal dos DNAs do plasmídeo deve ser determinada de acordo com a eficiência de transfecção de cada plasmídeo.

2. Esterilização de instrumentos cirúrgicos e

1. instrumentos cirúrgicos de autoclave salina e solução de NaCl a 0,9%.

3. Preparação da micropipeta de vidro

1. Puxe as pipetas de vidro usando um extrator de pipeta. Corte a ponta da pipeta com um diâmetro de 30-50 μm. Use os seguintes parâmetros: Calor, 600; Velocidade, 50; Tempo, 75.

4. Cirurgia Animal, Injeção de DNA e Eletroporação

NOTA: Uma visão geral desta etapa é descrita na Figura 1. Embora o procedimento para filhotes de rato seja descrito aqui, o método também é aplicável a animais mais maduros usando o mesmo procedimento.

1. Anestesiar o rato com isoflurano na caixa de indução até que o animal fique imóvel, ajustando o fluxo de oxigênio para 0,4 L/min e a concentração de isoflurano para 4% (vol/vol). Faça o beliscão do dedo do pé para confirmar a anestesia adequada.
2. Coloque o rato no aquecedor pré-aquecido sob um microscópio binocular e mantenha a anestesia administrando continuamente isoflurano através da máscara facial. Ajuste o fluxo de oxigênio para 0,2 L / min e a concentração de isoflurano para 2% (vol / vol). Use colírios para evitar o ressecamento dos olhos se os olhos do animal estiverem abertos.
3. Fixe as pernas com fita cirúrgica.
4. Limpe a pele da parte posterior da coxa com iodopovidona e faça uma incisão com bisturi
   NOTA: Depile as áreas cirúrgicas se estiverem cobertas de pelos.
5. Exponha o nervo ciático criando uma abertura entre o músculo quadríceps femoral e o músculo bíceps femoral com agulhas de costura.
6. Molhe o nervo com solução de NaCl a 0,9%. Absorva o excesso de água com papel sem fiapos.
7. Insira a base de uma micropipeta de vidro em um tubo flexível e encha a quantidade adequada de solução de DNA (pelo menos um microlitro) na micropipeta aspirando suavemente.
8. Levante o nervo exposto puxando suavemente o lado distal do nervo usando uma agulha.
   NOTA: Não aplique tensão no nervo para minimizar o estresse mecânico.
9. Insira a micropipeta de vidro no local distal do nervo e injete a solução de DNA aplicando pressão (ou seja, soprando na extremidade aberta do tubo flexível). Injete a solução de DNA até que o nervo pareça verde (máximo de 1 μl). Como a inserção frequente da micropipeta pode danificar o nervo, não insira a micropipeta mais de duas vezes.
10. Coloque um eletrodo de platina do tipo pinça a cerca de 1-2 mm de distância do nervo. Preencha o espaço entre o eletrodo e o nervo com solução de NaCl a 0,9%.
    NOTA: Não segure o nervo com o eletrodo para evitar estresse mecânico no nervo.
11. Aplique pulsos elétricos no local da injeção usando um eletroporador com o eletrodo. Após o primeiro conjunto de pulsos, inverta o eletrodo e aplique outro conjunto de pulsos. Use os seguintes parâmetros: tensão, 50 V; duração do pulso, 5 mseg; intervalo de pulso, 100 mseg; número de pulso, 4 vezes.
12. Limpe o local da eletroporação com solução de NaCl a 0,9%.

5. Pós-eletroporação

1. Feche as incisões com cola de cianoacrilato.
2. Depois de secar a cola, limpe a ferida com iodopovidona.
3. Solte o filhote da máscara facial. Aqueça o filhote em um aquecedor por pelo menos uma hora para permitir que ele se recupere totalmente da anestesia.

Resultados

Figura 1: Esquema do Método de Eletroporação in vivo. Primeiro, o nervo ciático do rato anestesiado é exposto. Em segundo lugar, o DNA do plasmídeo é injetado no nervo ciático. Terceiro, os pulsos elétricos são entregues ao local da injeção através do ele...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Genopure plasmid Maxi kit	Roche	03 143 422 001	Kit de purificação de DNA de plasmídeo
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Corante para injeção de DNA
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Vidro tubulação de
sucção	Drummond	05-2000-00	Tubulação de sucção para micro injeção
MODELO P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.	Extrator de
CUY21 Eletroporador	BEX	CUY21	Gerador de pulso
Aquecedor elétrico	KODEN	CAH-6A	Aquecedor durante a cirurgia
Isofluolano	Mylan	1119701G1076	Anestésico

capilar micropipeta de célula única de célula única