Entrega sustentada do fator de crescimento nervoso usando um filme de silício poroso em células de feocromocitoma 12 de ratos

Resumo

Fonte: Rosenberg, M., et al. Projetando filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento nervoso. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o uso de um filme de silício poroso nanoestruturado degradável (PSi) para a liberação sustentada do fator de crescimento nervoso (NGF) para apoiar a diferenciação celular PC12. O NGF é adsorvido nos poros do filme por meio de interações eletrostáticas e é gradualmente liberado no meio por difusão e degradação do andaime. Essa entrega controlada promove a sobrevivência das células PC12 e facilita o crescimento e a ramificação dos neuritos por um período prolongado.

Protocolo

1. Fabricação de transportadores de silício poroso oxidado (PSiO₂)

1. Corte um wafer de silício (Si) (lado único polido na face <100> e fortemente dopado com boro, tipo p, 0,95 mΩ · cm) em amostras de 1,5 cm × 1,5 cm usando uma caneta com ponta de diamante.
2. Oxidar as amostras de Si num forno tubular a 400 °C durante 2 h em ar ambiente (taxa de aquecimento: 25 °C/min, arrefecimento natural).
3. Mergulhe as amostras de Si em uma solução de ácido fluorídrico aquoso (HF) (48%), água bidestilada (ddH₂O) e etanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) por 5 min; em seguida, enxágue as amostras com etanol três vezes e seque sob uma corrente de nitrogênio.
   NOTA: Prepare e armazene a solução de HF apenas em material plástico, pois o HF dissolve o vidro.
   CUIDADO: HF é um líquido altamente corrosivo e deve ser manuseado com extremo cuidado. Em caso de exposição, enxágue abundantemente com água e trate a área afetada com gel de antídoto HF; procure atendimento médico imediatamente.
4. Monte a amostra de Si em uma célula de corrosão de politetrafluoretileno, usando uma tira de papel alumínio como contato traseiro e uma bobina de platina como contra-eletrodo.
5. Condicionar uma camada sacrificial em uma solução 3:1 (v/v) de HF aquoso e etanol (99,9%) por 30 s a uma densidade de corrente constante de 250 mA/cm²; em seguida, enxaguar a superfície do filme PSi resultante com etanol três vezes e secar sob uma corrente de nitrogênio.
6. Dissolva a camada porosa recém-gravada em uma solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH) (0,1 M) por 2 min. Em seguida, enxágue com etanol três vezes e seque sob uma corrente de nitrogênio.
7. Mergulhe a amostra em uma solução aquosa de HF (48%), ddH₂O e etanol (99,9%) (1:1:3 v/v) por 2 min. Em seguida, enxágue com etanol três vezes e seque sob uma corrente de nitrogênio.
8. Condicionar eletroquimicamente a amostra de Si em uma solução 3:1 (v/v) de HF aquoso e etanol (99,9%) por 20 s a uma densidade de corrente constante de 250 mA/^cm2; em seguida, enxaguar a superfície do filme PSi resultante com etanol três vezes e secar sob uma corrente de nitrogênio.
9. Oxidar termicamente as amostras de PSi recém-gravadas em um forno tubular a 800 °C por 1 h em ar ambiente (taxa de aquecimento: 25 °C/min, resfriamento natural) para formar um andaime poroso de SiO₂ (PSiO₂).
10. Gire as amostras PSiO₂ com um fotorresistente espesso positivo a 4.000 rpm por 1 min; em seguida, asse as amostras revestidas a 90 ° C por 2 min (taxa de aquecimento: 5 ° C / min, resfriamento natural).
11. Corte as amostras do PSiO₂ em amostras de 8 mm × 8 mm usando uma serra de cortes.
12. Para remover o fotorresistente, mergulhe as amostras em cubos em acetona por 3 h; em seguida, enxágue bem com etanol e seque sob uma corrente de nitrogênio.

2. Carregando PSiO₂ com fator de crescimento nervoso (NGF)

1. Para preparar a solução de carga de NGF, dissolva 20 μg de β-NGF murino em 400 μL de solução 1:1 (v/v) de solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS) e ddH₂O.
2. Adicione 52 μL da solução de carregamento em cima da amostra PSiO₂ e incube por 2 h em temperatura ambiente (RT) em um prato tampado.
   NOTA: Mantenha alta umidade no prato para evitar que a solução seque durante a incubação.
3. Colete a solução em cima da amostra para posterior quantificação do conteúdo de NGF dentro do transportador PSiO₂.
   NOTA: O carregamento de NGF no PSiO₂ deve ser realizado imediatamente antes do uso pretendido; o protocolo não pode ser pausado aqui devido ao risco de secagem e desnaturação da proteína.

3. Viabilidade e crescimento celular na presença de portadores de PSiO₂ carregados com NGF Cultura de

1. células de feocromocitoma de rato (PC12
   1. Prepare o meio de crescimento básico adicionando 10% de soro de cavalo (HS), 5% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio do Roselle Park Medical Institute (RPMI).
   2. Prepare um meio de diferenciação adicionando 1% de HS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio RPMI.
   3. Cultivar a suspensão celular (10⁶ células) num balão de cultura^{de 75 cm 2} com 10 ml de meio de cultura de base durante 8 dias; de 2 em 2 dias, adicionar 10 ml de meio de cultura de base ao balão.
   4. Para gerar uma cultura de células PC12 diferenciada, transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação; centrifugar as células durante 8 min a 200 x g e RT. Rejeitar o sobrenadante.
   5. Suspender as células em 5 ml de meio de crescimento básico fresco e centrifugar novamente as células durante 5 min a 200 x g e RT; rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 3 ml de meio de crescimento básico.
   6. Para separar os aglomerados de células, aspire as células dez vezes usando uma seringa de 23 G.
   7. Conte as células usando um contador de células hemocitômetro e semeie 10⁴ células/cm² área de trabalho em placas revestidas com colágeno tipo I na presença de meio de diferenciação.
   8. Após 24 h, adicione β-NGF murino fresco (50 ng/mL) ou transportador PSiO₂ carregado com NGF por placa.
      >NOTA: Concentrações mais altas de NGF (>50 ng/mL) possuem o efeito exato como a concentração especificada.
   9. Renove o meio de diferenciação a cada 2 dias.
   10. Para avaliar a viabilidade celular, adicionar 10% (v/v) da solução indicadora de viabilidade (à base de resazurina) em pontos de tempo representativos e incubar durante 5 h a 37 °C; medir a absorvância a 490 nm utilizando um espectrofotómetro.

Materiais

< >< tabela classe = 'ck-table-resized'>< col estilo = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'>< estilo col = 'largura: 25%;'> Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários acetonaGadot830101375 AnfotericinaIndústrias Biológicas03-028-1B HF aquoso (48%)Merck101513 AZ4533 fotorresistenteMetal Chem, Inc.AZ4533 BSA fração vMP biomedicals216006950 solução BSA (10%)Biological Industries03-010-1B Colágeno tipo lCorning Inc. 354236 ColagenaseEncoLS004176 lamínulas de plástico revestidas com colágenoNUNC Thermanox1059846 D-(+)-glicoseSigma-Aldrich ChemicalsG8170 Dispase-IISigma-Aldrich Chemicals4942078001 Etanol absoluto (99,9%)Merck818760 FBSBiological Industries04-121-1A Guanidina-HClSigma-Aldrich ChemicalsG7294 Mistura de nutrientes F-12 do presuntoThermo Scientific11765054 HBSSThermo Scientific14185-045 HEPES (1M)Thermo Scientific15630-056 HSBiological Industries04-124-1A L-15 médioSigma-Aldrich ChemicalsL5520 LamininThermo Scientific23017015 L-glutaminaBiological Industries03-020-1A Murine β-NGFPeprotech450-34-20 Burro normal soro (NDS)Sigma-Aldrich ChemicalsG9023 PapaínaSigma-Aldrich Chemicalsp-4762 PBS (pH 7,4) Preparado dissolvendo 10 mM de Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM de NaCl e 2,7 mM de KCl em água bidestilada (ddH₂O, 18 MΩ·cm).PBS X10Biological Industries02-020-1A Linha celular PC12ATCCCRL-1721 Penicilina-estreptomicinaBiological Industries03-032-1B Poli-L-lisinaSigma-Aldrich ChemicalsP4832 PrestoBlue reagenteThermo ScientificA13261 RPMI mediumBiological Industries01-100-1A Si waferSiltronix Corp. Altamente dopado com B, tipo p, resistividade de 0,00095 Ω cm, <100> orientado azidade sódioSigma-Aldrich ChemicalsS2002 Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-Aldrich ChemicalsS8045 Ácido tânicoSigma-Aldrich Chemicals403040 Triton X-100Chem-Impex International Inc.1279