Injeção de peptídeos automontáveis e células precursoras neurais para reparo da medula espinhal em um modelo de rato

Abstract

Fonte: Zweckberger, K., et al. Uso sinérgico de células precursoras neurais e peptídeos auto-montáveis em lesão experimental da medula espinhal cervical. J. Vis. Exp. (2015).

Este protocolo demonstra uma abordagem de injeção direcionada para reparo de lesão medular em um modelo de rato. Envolve a entrega de peptídeos de automontagem (SAPs) no núcleo da lesão para criar um andaime de suporte, seguido por injeções de células precursoras neurais (NPC) ao redor da lesão para remodelar o tecido.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Modelo de contusão/compressão com clipe de aneurisma cervical

1. Antes da cirurgia, autoclave os instrumentos e mantenha-os estéreis durante todo o procedimento cirúrgico, colocando-os em um banho de álcool a 70%.
2. Anestesiar ratos Wistar (250-270 g) com uma combinação de oxigênio (O₂), óxido nitroso (N₂O) (1:1) e 1,8-2,2% de isoflurano e apoiar a respiração espontânea por meio de uma máscara de anestesia gasosa. Para indução da anestesia, comece com isoflurano a 5% por 1 minuto e reduza depois. Antes de iniciar a cirurgia, controle a profundidade da anestesia dando um estímulo doloroso (por exemplo, nas patas). Aplique pomadas gordurosas nos olhos para evitar o ressecamento e prevenir infecções subsequentes.
3. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento (37 ° C) e fixe a cabeça em uma estrutura estereotáxica.
4. Depile a região cirúrgica ao redor da coluna cervical e desinfete com iodopovidona e álcool 70%.
5. Faça uma incisão na linha média acima da coluna vertebral a partir da vértebra cervical (C2) atingindo o processo proeminente do corpo vertebral torácico 2 (T2).
6. Corte a camada externa dos músculos vertebrais diretamente na linha média (para evitar sangramento) na direção crânio-caudal e disseque ainda mais as camadas musculares mais profundas sem corte até chegar ao processus spinosus e às lâminas. Inserir retractores.
7. Orientar o processo espinhoso proeminente do corpo vertebral T2 para observar os níveis-alvo para laminectomia. Após a identificação e preparação microcirúrgica das lâminas selecionadas, corte os ligamentos flavae para soltar as lâminas e o processus spinosus. Por fim, corte as lâminas com um cortador de osso lateral à medula espinhal e remova-as suavemente, evitando qualquer compressão da própria medula espinhal.
   NOTA: Os níveis mais comuns são C5/6, C6/7 ou C7/T1. A taxa de mortalidade perioperatória aumenta quanto mais rostral for o nível da lesão. O sangramento do seio venoso paravertebral é comum e pode ser tratado por compressão cuidadosa com uma esponja.
8. Antes de inserir o clipe para traumatizar o cordão, identifique as raízes nervosas emergentes para poupá-las do corte (especialmente nos níveis C5/6).
9. Para garantir uma indução suave do clipe, solte a dura-máter ventral do lado dorsal dos corpos vertebrais com um gancho e prepare um corredor para o clipe.
10. Por fim, insira o clipe aberto e deixe-o fechar (fechamento rápido) para obter uma lesão por contusão. A força de fechamento do clipe e a duração do fechamento do clipe determinam a intensidade do trauma e a extensão da compressão. Comumente usadas são forças de clipe entre 15-35 g e uma duração de corte de, por exemplo, 1 min.
11. Após a remoção do clipe, adapte os músculos em 2 camadas e feche a ferida.
12. Pare a anestesia e deixe o animal acordar sob sua observação contínua até que ele recupere a consciência suficiente para a decúbito esternal. Por fim, coloque o rato em uma única gaiola e siga as orientações de tratamento pós-operatório.
13. Como os animais lutam com a gravidade desse tipo de lesão, você deve prestar atenção especial aos tratamentos pós-operatórios:
    1. Administre analgésicos (Buprenorfina e Meloxicam por 3 dias e 5 dias, respectivamente, e de acordo com os sintomas clínicos).
    2. Administre solução salina adicional por via subcutânea por 3 dias (2 vezes ao dia, 5-10 mililitros (ml)).
    3. Forneça antibióticos na água potável 2 dias antes e até 7 dias após a cirurgia (por exemplo, moxifloxacina)
    4. Aperte a bexiga urinária 2-3 vezes ao dia até que a recuperação da função da bexiga seja constantemente aparente.
    5. Observar déficits neurológicos e condição fisiológica dos animais operados pelo menos uma vez ao dia.

2. Injeção de SAPs e NPCs (14 dias após a lesão)

1. Induza a anestesia conforme descrito em 1.1 a 1.3, fixe a cabeça do rato em uma estrutura estereotáxica, remova os pontos ou clipes da ferida e desinfete a ferida e a área cirúrgica com iodopovidona e álcool 70%.
2. Disseque cuidadosamente os músculos paravertebrais, insira afastadores, remova o tecido cicatricial microscopicamente da dura-máter e reexponha o local da lesão.
3. Prepare SAPs na concentração de 1% (p/v) para realizar um gel de matriz extracelular. Os SAPs QL6 têm um pH fisiologicamente compatível e não precisam ser tamponados antes da injeção. Para visualização de SAPs na medula espinhal, use um derivado fluorescente de QL6 (QL6-isotiocianato de fluoresceína [FITC]).
4. Injete SAPs (5 microlitros (μl) no centro da lesão, distribuídos em 2 porções, cada uma com 2,5 μl bilateralmente da linha média. Use uma seringa Hamilton conectada à estrutura estereotáxica com um micro capilar de vidro (100 micrômetros (μm) de diâmetro externo [OD]). Abra a dura-máter cuidadosamente com a ponta de uma agulha afiada e insira o capilar de vidro estereotático 2 milímetros (mm) na medula espinhal traumatizada.
5. Depois de injetar 1/3 do volume, remova a agulha até 1,5 mm de profundidade e depois de mais 1/3 a 1 mm. Após a injeção de todo o volume e antes da remoção da seringa, aguarde 5 minutos para estabilizar a formação do gel.
6. Para gerar NPCs, use camundongos adultos com proteína fluorescente vermelha de discosoma (DsRed) (ou camundongos positivos para proteína fluorescente amarela [YFP], verde) e isole-os e cultive-os a partir da zona paraventricular.
7. Avalie a viabilidade dos NPCs pela coloração com Trypan Blue, que indica a presença de ~ 90% de células vivas na suspensão celular. Diluir as células num meio de cultura (50 x 10³ células vivas/μl) e depois utilizá-las para transplante de células.
8. Faça quatro injeções intraespinhais de 2 μl (8 μl de volume total, contendo 4 x 10⁵ NPCs) bilateralmente a 2 mm rostral e caudal do local da lesão. Depois de abrir a dura-máter, insira o micro capilar de vidro Hamilton 1,5 mm abaixo da superfície dorsal da medula espinhal e injete 2 μl da suspensão celular. Escolha uma taxa de injeção de cerca de 0,5 μl / min (min).
9. No final de cada injeção e antes da remoção do capilar do cordão, aguarde pelo menos 1 min, permitindo o alongamento do tecido para acomodar o novo volume celular. (Figura 2)

Results

Figura 1: Modelo de aneurisma de contusão/compressão de clipe. (UMA) Fotografia através do microscópio cirúrgico após laminectomia de C7/T1 e contusão/compressão com clipe da medula espinhal de um rato. (B) I...

Materials