Manipulação optogenética de circuitos neurais para a transição do sono para a vigília em camundongos

Resumo

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de estados de sono/vigília em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a manipulação optogenética de circuitos neurais envolvidos na transição do sono para a vigília em camundongos. O procedimento envolve a implantação cirúrgica de uma fibra óptica e eletrodos no cérebro e nos músculos para permitir a estimulação da luz e o registro eletrofisiológico. Ao fornecer luz para ativar canais catiônicos sensíveis à luz no núcleo do leito da estria terminal (BNST), a atividade neuronal é modulada, permitindo que os pesquisadores analisem os sinais cerebrais e musculares associados à indução da vigília.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cirurgia Animal, Injeção de Vírus, Eletrodo para EEG/EMG e Implante de Fibra Óptica

CUIDADO: Técnicas apropriadas de proteção e manuseio devem ser selecionadas com base no nível de biossegurança do vírus a ser usado. O vírus adeno-associado (AAV) deve ser usado em uma sala isolada com classificação P1A para injeção, e o tubo que transporta o AAV deve ser esterilizado com uma autoclave após o esgotamento de todo o volume. O local cirúrgico e todo o material implantado devem estar limpos e estéreis durante o uso.

NOTA: Consulte a Figura 1.

1. Desinfete o equipamento cirúrgico com a autoclave.

2. Anestesie camundongos com isoflurano usando um vaporizador anestésico. Observe até que o camundongo atinja a profundidade desejada de anestesia, determinada pela perda de resposta ao beliscar a cauda com uma pinça. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem.

3. Desinfete o campo cirúrgico com solução de iodo ou etanol a 70% (EtOH, 3x) e seque o suficiente. Permita que o vírus descongele no gelo enquanto a cirurgia está sendo realizada. Cubra a área cirúrgica com papel absorvente de bancada de laboratório.

4. Fixe a cabeça do mouse no aparelho estereotáxico com barras auriculares e uma pitada no nariz. Depois de confirmar que a cabeça está mantida estável, faça uma incisão sagital mediana no couro cabeludo para garantir que as posições do bregma e lambda estejam localizadas no mesmo nível em uma linha horizontal.

5. Para evitar uma lacuna de posicionamento, ajuste adequadamente os níveis da pinça do nariz e das barras auriculares para cima e para baixo. O bregma e o lambda referem-se à intersecção entre a sutura saggitalis e a sutura coronalis ou sutura lambdoidal, respectivamente (Figura 2).

6. Use grampos Serafin para segurar a pele para manter o acesso ao crânio. Após a exposição do crânio, desinfetar a superfície do crânio com iodo ou 5% de H₂O₂, para permitir que as suturas cranianas, incluindo o bregma e o lambda, sejam visualizadas com mais clareza.

7. Prepare a injeção do vetor AAV:

1. Lave o interior de uma seringa de 10 mL (consulte a Tabela de Materiais) sequencialmente com 70% de EtOH, 100% de EtOH e água esterilizada, 5 vezes cada. Fixe a seringa no clamp de um braço da bomba de microinjeção e certifique-se de que toda a solução na seringa seja descarregada.

2. Aspire cuidadosamente 2 μL de óleo mineral sem bolhas de ar e, em seguida, aspire o volume designado da solução do vírus. Após a aspiração, manipule o botão do êmbolo e confirme se a solução do vírus emerge na ponta da agulha.

NOTA: O volume de injeção da solução viral foi determinado em experimentos piloto usando a mesma cepa de camundongo e o mesmo produto de vírus. A relação entre o volume da solução do vírus e a extensão da área de infecção deve ser estimada com antecedência.

8. Injete o vetor AAV:

1. Ajuste a ponta da agulha de microinjeção no bregma e anote as coordenadas como o ponto original. Mova a ponta para o local de injeção designado (para o BNST: ântero-posterior + 0,2 mm, ± mediolateral 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) e coloque a ponta da agulha na posição. Coloque uma marca no crânio e faça furos de aproximadamente 2 mm de diâmetro usando uma broca odontológica com um cortador de metal duro de 0,7 mm. Tenha cuidado para não danificar a dura-máter ou o tecido cerebral.

2. Depois de remover o sangue ao redor dos orifícios com um cotonete, mova lentamente a agulha para a posição do BNST. Injete lentamente a quantidade designada de solução de vírus (0,07 μl/min) com um microinjetor mecânico. Depois de completar a injeção, deixe a agulha por 5 minutos para permitir que a solução se infiltre suficientemente no tecido BNST. Remova cuidadosamente a agulha.

3. Para injeções bilaterais, repita as etapas 1.8.1-1.8.2 do outro lado. Durante todo o procedimento, aplique solução salina estéril para manter o crânio úmido.

NOTA: Usamos implantes personalizados de eletroencefalografia (EEG)/eletromiografia (EMG) (largura: 5 mm, profundidade: 7 mm, altura: 1 mm) com quatro eletrodos de EEG (4 mm), dois eletrodos EMG (2 mm; corte o eletrodo de 4 mm para 2 mm com pinças) e 6 eletrodos (4,5 mm) (Figura 2A).

9. Solde dois fios de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais) dos quais 1 mm do isolamento é retirado de ambas as extremidades dos eletrodos EMG. Ajuste o centro dos eletrodos ao bregma, marque a posição de cada eletrodo de EEG (± anteroposterior 1,5 mm, ± médio-lateral 1,0 mm) e determine a posição do implante (Figura 2B).

10. Implante de fibras ópticas:

1. Conecte uma ponteira de fibra óptica ao manipulador e gire o braço do manipulador de forma que ele tenha um ângulo de ±30° contra uma linha horizontal (esse processo só é necessário para evitar interferência entre eletrodos e fibras ópticas, como no caso de estimulação BNST). Coloque a ponta de fibra no bregma e registre as coordenadas.

2. Mova a ponta para a linha de inserção desejada e marque a posição no crânio. Além disso, coloque marcas adicionais perto do local de inserção para os parafusos de ancoragem. Perfure o crânio em cada local com uma broca odontológica para inserir a fibra óptica e fixar o parafuso. Fixe o parafuso no crânio. Tenha cuidado para não quebrar a dura-máter ou danificar qualquer tecido com o parafuso.

3. Insira a fibra óptica suavemente até chegar acima do BNST com um manipulador. A ponteira deve repousar sobre o crânio remanescente (Figura 1B).

4. Aplique cimento dentário fotocurável (ver Tabela de Materiais) para cobrir a fibra e o parafuso. O tempo de reação para solidificar a cola deve ser especificado pelo manual do fabricante (Nosso material precisa de exposição à luz por pelo menos 10 segundos com fotogeradores de comprimento de onda específico. Não é necessário secar a cola depois disso).

5. Nesta etapa, certifique-se de que nenhum material (parafusos ou cola) ocupe o espaço de montagem dos eletrodos. Além disso, evite fazer qualquer interrupção no cimento para a conexão da ponteira à fibra óptica e ao cabo. Repita as etapas 1.10.1-1.10.4 no lado oposto para estimulação bilateral.

11. Faça furos para eletrodos de EEG/EMG. Insira as pontas dos eletrodos nos orifícios. Segure o implante e aplique adesivo de cianoacrilato no espaço entre o crânio e os eletrodos. Insira novamente com atenção para não interferir em nenhum material.

12. Cubra a circunferência dos eletrodos e fibras ópticas com adesivo de cianoacrilato, seguido da aplicação de acelerador de cianoacrilato no adesivo. Esta etapa evita causar qualquer interrupção na zona de conexão da ponteira ao cabo óptico e do eletrodo ao fio condutor (Figura 1C).

NOTA: O adesivo de cianoacrilato e seu acelerador são prejudiciais ao olho do rato. Preste atenção para não causar derramamento dessas substâncias químicas. Além disso, tome cuidado para não tocar fortemente nos eletrodos e nas fibras para evitar desvios inesperados imediatamente após a solidificação do adesivo.

13. Exponha os músculos do pescoço do rato e insira os fios do elétrodo EMG sob o músculo. Ajuste o comprimento do eletrodo EMG para que ele fique localizado logo abaixo dos músculos da nuca. Uma conexão leve entre a ponta do eletrodo e a fáscia muscular é suficiente para captar o sinal EMG.

14. Aplique adesivo de cianoacrilato para preencher os implantes e solidificar o adesivo com líquido de aceleração. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para recuperação até que o reflexo postural apareça. Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento à temperatura corporal em repouso do animal (36,0 °C em ZT 0-12 no caso de ratinhos C57BL6; não exceder 38,0 °C).

NOTA: Um antibiótico não é necessário para cirurgia estéril. Siga as diretrizes institucionais locais para analgesia pós-operatória. Mantenha os ratos em uma gaiola doméstica por um período de recuperação de pelo menos 7 dias.

2. Monitoramento de EEG/EMG com Fotoexcitação de Neurônios-Alvo em Estados Específicos de Sono

CUIDADO: Este protocolo inclui o uso de equipamentos a laser classe 3B ou dispositivos LED. Os experimentadores devem estar cientes das informações de segurança. São necessários óculos de proteção.

1. Antes de conectar o cabo do laser à fibra óptica, ajuste a intensidade do laser com um scaler. Amarre a ponta do cabo do laser a uma fibra óptica não utilizada com uma ponteira e confirme se não há espaço na junção entre a fibra e o cabo.

2. Ligue o interruptor principal do laser e aguarde 20 minutos para que ele aqueça.

3. Emita o laser para o verificador de intensidade e ajuste a intensidade do laser para 10 mW/mm². Altere o modo do laser para a lógica do transistor e confirme se os pulsos de luz são emitidos da fibra controlada pelo regulador de padrão, que é definido em 10 ms para duração, 40 ms para repouso, 20 vezes para ciclo e 20 vezes repetição (ou seja, 20 Hz de pulsos de luz de 10 ms por 20 s).

4. Após o período de recuperação, mova os camundongos para a câmara experimental para registrar EEG / EMG. Os camundongos domésticos foram mantidos a uma temperatura constante de 23 ° C com um ciclo claro/escuro de 12 h com comida e água disponíveis ad libitum.

5. Conecte o eletrodo implantado e o adaptador de cabo que está preso a um anel deslizante para evitar emaranhamento. Recomenda-se cobrir a junção com material impermeável à luz, como folha de alumínio, para evitar vazamento de laser. Se for necessária uma experiência bilateral, use um anel deslizante com uma fixação bifurcada para os cabos.

6. Neste protocolo, avaliamos a latência para a vigília do sono sem movimento rápido dos olhos (NREM) ou sono de movimento rápido dos olhos (REM), portanto, o tempo de gravação deve ser limitado no tempo zeitgeber otimizado (ZT0 é definido como o tempo em que a luz está acesa). Este protocolo foi realizado entre ZT4 - ZT10. Deixe os camundongos permanecerem livremente na câmara experimental por pelo menos 1 h como aclimatação.

7. Durante o período experimental, monitore os sinais de EEG e EMG no mesmo monitor e avalie o estado do mouse como vigília, sono NREM ou sono REM. Use o controle de ganho para cada onda para facilitar a distinção de cada estado.

8. Para medição da latência do sono NREM à vigília, observe o sono NREM estável por 40 s ou o sono REM estável por 30 s e, em seguida, ligue o interruptor do gerador de padrões para fotoestimulação (este protocolo gera 20 Hz de pulsos de luz de 10 ms por 20 s). Confirme a emissão do laser para as fibras ópticas implantadas.

9. Registre sinais de EEG / EMG até que o estado de sono mude para vigília. Se forem necessários dois ou mais ensaios experimentais, limite a manipulação optogenética a uma vez por dia, pois a fotoestimulação é uma intervenção artificial que pode afetar a arquitetura do sono/vigília.

10. Após o experimento, anestesiar profundamente e perfundir com solução salina estéril e paraformaldeído (PFA) para amostragem de todo o cérebro para análise imuno-histoquímica.

Resultados

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br />Figura 1: Procedimento para injetar AAV, implante de fibras ópticas e implantes de EEG/EMG. (A) Procedimento experimental de injeção de vírus. O gene ChR2 ou EYFP (para controle) fundido com EYFP incorporado em um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x1 Juntas rotativas de fibra óptica	Doric	FRJ 1x1 FC-FC	para optogenética
6-pin header	KEL corporation	DSP02-006-431G
Soquete de 6 pinos	Hirose	21602X3GSE
Conversor A/D	Nippon koden	N/A	Conversor analógico-digital
AAV_{10} -EF1a-DIO-ChR2-EYFP			3.70×10^{13} (cópias genômicas/ml)
AAV_{10} -EF1a-DIO-EYFP			5.82×10^{13} (cópias genômicas/ml)
Ampicilina	Fuji filme	014-23302
Amplificador	Nippon koden	N/A	para gravação de EEG/EMG
Vaporizador anestésico	Muromachi	MK-AT-210D
Injetor automático	KD científico	780311
cortador de carboneto	Minitor	B1055	φ0,7 mm. Reffered como broca odontológica, usado com micromotor rotativo de alta velocidade
Adesão de cianoacrilato (Aron alfa A) e aceleração	Konishi	#30533
Luz de polimerização dentária	3M	Elipar S10
Adesivo epóxi	Konishi	# 04888	isolamento ao redor da solda de 6 pinos e cabo blindado
Cabo de remendo de fibra óptica (ramificação)	Doric	BFP (#) _50/125/900-0.22
Camundongos GAD67-Cre	fornecidos pelo Dr. Kenji Sakimura		O gene Cre recombinase é batido no alelo Gad67
Seringa Hamilton	Hamilton	65461-01
Kit de micromotor rotativo de alta velocidade	FOREDOM	K.1070	Usado com cortador de carboneto
Luva de interconexão	Thorlab	ADAF1	φ2,5 mm
Isoflurano	Pfizer	871119
Laser	Rapp Optoeletrônico	N/A	473nm comprimento
Verificador de intensidade a laser	COHERENT	1098293
Estimulador a laser	Bio centro de pesquisa	STO2	referenciado como gerador de pulso em texto
Fibra óptica com ponteira	Thorlab	FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10	fornecido por PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA	Addgene	plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA	fornecido pelo Dr. Karl Deisseroth
Patch cord	Doric	D202-9089-0.4	0.4m de comprimento, condutor de laser entre o laser e a junta rotativa
pHelper	Stratagene
Cimento dentário fotocurável	3M	56846
Braçadeira Serafin	Stoelting	52120-43P
Cabo blindado	mogami	W2780	Solda a soquete de 6 pinos para gravação de EEG/EMG
Câmara de gravação de sono	N/A	N/A	Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) com suporte de tanque de água
Software de sinal de sono	KISSEI COMTEC	N/A	para análise de EEG/EMG
Neurociência do anel deslizante	, inc	N/A	para análise de EEG/EMG
Parafuso inoxidável	Yamazaki	N/A	φ1.0 x 2.0
Fio inoxidável	Fio Cooner	AS633	0.0130 polegadas de diâmetro
Quadro estereotáxico com console digital	Koph	N/A	Modelo 940
Agulha de seringa	Hamilton	7803-05
Software de gravador vital	KISSEI COMTEC	N/A	para gravação de EEG/EMG

cerâmico de onda