Estimulação do nervo vago por meio de eletrodos de manguito de nervo periférico implantados cronicamente em ratos

Resumo

Fonte: Sanchez, C. A., et al. Preparação de eletrodos de estimulação de nervos periféricos para implantação crônica em ratos. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a estimulação do nervo vago em um rato acordado. Um rato com um eletrodo de manguito de nervo periférico crônico implantado e treinado em uma tarefa de pressão de alavanca é conectado a um gerador de estímulo por meio de uma tampa de cabeça implantada. O nervo vago é estimulado imediatamente após cada pressão bem-sucedida da alavanca, resultando na expansão do mapa motor.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Fabricação de eletrodo de manguito estimulante

1. Prepare o tubo do manguito.
   1. Usando uma lâmina de barbear, corte um pedaço de tubo de polímero de 2,5 mm de comprimento. Insira as pontas dos fórceps ou um clipe de papel no tubo e use a lâmina para fazer uma fenda longitudinal na parede do tubo em um lado do manguito.
   2. Remova a pinça do tubo e insira uma agulha de costura grande na linha média do manguito, perpendicular ao eixo longo. Insira a agulha através da fenda (superior) e no centro do tubo oposto (inferior). Coloque a agulha na placa de espuma para prender o manguito no lugar durante as etapas restantes da montagem.
2. Coloque uma sutura para prender o fechamento do manguito durante o implante.
   1. Insira a pequena agulha de costura na parede do manguito, na linha média, a cerca de 0,5 mm da fenda superior de um lado. Insira a agulha de dentro para fora para evitar danificar o tubo do manguito. Insira uma sutura 6/0 de 2 cm de comprimento no buraco da agulha e puxe a agulha através da parede do tubo para enfiar a sutura no manguito.
   2. Deixando a linha no lugar, remova a agulha e faça um segundo orifício na parede do tubo aproximadamente 0,5 mm abaixo do primeiro orifício, ao longo da linha média do manguito. Insira a sutura pelo buraco da agulha e puxe a agulha pela parede do tubo para enfiar novamente a sutura no manguito.
   3. Ambas as extremidades do fio de sutura devem agora estar no lado externo do manguito. Ajuste a sutura de modo que ~1,5 cm se estenda do orifício superior e ~0,5 mm se estenda do orifício inferior.
   4. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV (ultravioleta) na extremidade curta da sutura que se estende do orifício inferior e puxe a extremidade mais longa da sutura até que a cauda inferior esteja quase nivelada com a parede externa do tubo. Use a varinha UV para curar o adesivo e segure a sutura firmemente no lugar.
   5. Repita as etapas 1.2.1 a 1.2.3 no lado oposto do manguito.
3. Coloque os fios de platina: irídio (Pt: Ir).
   1. Use a pequena agulha de costura para fazer 4 furos na parede do punho. Cada par de orifícios deve ser colocado a aproximadamente 0,5 a 0,8 mm da linha média perpendicular, com um orifício a aproximadamente 0,5 a 0,8 mm da fenda superior em ambos os lados do manguito.
      CUIDADO: Para a colocação mais consistente e precisa dos eletrodos, insira a agulha de dentro para fora para fazer todos os orifícios, usando a colocação da sutura como guia.
   2. Insira a agulha de costura novamente, desta vez trabalhando de fora para dentro através do orifício de chumbo 1. Insira aproximadamente 0.5 cm de um comprimento de 7.5 cm de fio Pt:Ir através do buraco da agulha e puxe a agulha através do tubo para enfiar o fio condutor na parede do manguito. Ajuste o fio de forma que ~4.5 cm se estenda no lado externo do manguito (Figura 1A).
   3. Insira a agulha através do orifício de chumbo 1 novamente, novamente trabalhando de exterior para interior e, adicionalmente, insira a agulha através do orifício de chumbo 2 diretamente em frente ao orifício de chumbo 1. Insira ~0.5 cm da extremidade mais curta (interna) do fio Pt:Ir através do orifício da agulha e puxe a agulha através do tubo para enfiar o fio condutor através das paredes do manguito.
      NOTA: Ambas as extremidades do fio Pt:Ir devem agora estar no lado externo do manguito, e um laço de arame é formado ao redor da borda da fenda e através do orifício de chumbo 1 (Figura 1B).
   4. Repita as etapas 1.3.1 a 1.3.3 para colocar o fio Pt:Ir nos orifícios de avanço 3 e 4.
   5. Usando um isqueiro de butano, remova cuidadosamente o isolamento de um comprimento de 5 a 6 mm na extremidade dos fios Pt:Ir que se estendem do orifício de chumbo 2 e do orifício de chumbo 4.
      CUIDADO: Isole as extremidades dos fios do resto do conjunto do manguito com cuidado para evitar danos ao manguito. Use ferramentas para segurar os fios para evitar ferimentos.
   6. Alinhe o fio desencapado dentro do manguito para colocar os eletrodos em seus locais finais. Para fazer isso, puxe suavemente a extremidade do fio Pt:Ir que se estende do orifício 1 até que a parte não isolada do fio esteja nivelada com o orifício 1. Repita com o outro fio para alinhar a extremidade não isolada do fio rosqueado através dos orifícios 3 e 4.
   7. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV nas alças de arame no lado externo do manguito nos orifícios de chumbo 1 e 3. Use a varinha UV para curar o adesivo e prender os cabos no lugar.
   8. Use uma pequena ponta de pipeta para empurrar os fios de arame Pt:Ir não isolados contra a parede interna do manguito. Assim que os fios estiverem no lugar, corte as extremidades dos fios que se estendem dos orifícios 2 e 4 de modo que aproximadamente 1 mm de fio se estenda além do exterior da parede do manguito.
   9. Dobre as pontas de 1 mm do fio contra a superfície externa do manguito, tomando cuidado para não encurtá-las juntas. Aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV para cobrir apenas as duas caudas e cure o adesivo para proteger a colocação do eletrodo e fornecer isolamento elétrico.
      CUIDADO: É importante cobrir totalmente as superfícies Pt:Ir expostas externamente com adesivo para isolar os fios e evitar estimulação fora do alvo.
4. Prenda os fios Pt:Ir no lugar com a fixação da sutura.
   1. Remova a agulha grande com o conjunto do manguito da placa de espuma. Insira uma sutura 6/0 de 3 cm de comprimento no buraco da agulha e puxe a agulha pelo tubo para enfiar a sutura na parte inferior do manguito no ponto médio.
   2. Mude para a agulha de costura pequena para completar a linha de sutura para fixação do chumbo Pt:I. Insira a agulha pelo mesmo orifício da linha média, trabalhando novamente de dentro para fora para evitar a deformação do tubo e dos fios condutores. Insira a cauda externa da sutura através do buraco da agulha e puxe a agulha através da parede do manguito para criar um laço de sutura ao redor da borda do manguito (Figura 1C).
      NOTA: Use uma pinça e trabalhe sob o microscópio para garantir que a sutura esteja orientada ao longo do eixo longo do manguito e fique plana contra o tubo. Esta etapa garante que os eletrodos permaneçam separados no lado interno do manguito e sejam mantidos no lugar lateralmente à linha média do manguito.
   3. Crie um segundo laço ao redor da extremidade oposta do manguito amarrando as extremidades da sutura em um meio nó, no lado externo do manguito. Certifique-se de que a sutura corre ao longo do eixo longo do manguito e fica plana contra o tubo. Enquanto segura o nó firmemente para que fique plano contra o tubo, aplique uma pequena quantidade de adesivo de cura UV no meio nó e catalise para mantê-lo no lugar.
   4. Corte cuidadosamente as extremidades do fio de sutura o mais próximo possível do nó. Se necessário, use uma pequena quantidade de adesivo de cura UV adicional para colar as extremidades curtas da sutura de modo que fiquem planas contra o tubo (Figura 1D).
5. Solde os pinos do conector nos fios do fio Pt:Ir.
   1. Usando um isqueiro de butano, remova o isolamento de ~3 mm no final de cada um dos fios condutores Pt:I. Solde o lado do copo de um pino dourado (consulte a Tabela de Materiais) na extremidade não isolada de cada cabo.
6. Teste a impedância do dispositivo montado.
   1. Conecte os pinos dourados às entradas de um medidor LCR (Indutância (L), Capacitância (C) e Resistência (R)) ou módulo de verificação de impedância de eletrodo e defina a frequência de teste para 1 kHz. Mergulhe o tubo do manguito (e os contatos de estimulação Pt:Ir no interior do manguito) em um pequeno béquer cheio de solução salina, tomando cuidado para manter os pinos de chumbo dourados e os conectores da sonda secos. Verifique se o manguito montado tem uma impedância a 1 kHz inferior a 2 kΩ antes de prosseguir com a implantação.
      NOTA: A alta impedância geralmente indica área de superfície Pt:Ir inadequada exposta, que pode surgir devido a fatores como remoção insuficiente de isolamento, aplicação acidental de adesivo no interior do manguito, fios de arame quebrados, etc. Os manguitos também devem ser inspecionados quanto a fios de arame quebrados ou mal colocados que podem resultar em contatos em curto com o uso a longo prazo.

2. Construção da tampa da cabeça

NOTA: Os procedimentos de montagem da tampa da cabeça são semelhantes aos publicados anteriormente e estão resumidos aqui por conveniência.

1. Monte a tampa da cabeça
   1. Corte dois pequenos pedaços de envoltório de fio 30 AWG (American Wire Gauge), um ~13 mm de comprimento e um ~10 mm de comprimento. Descasque o isolamento de ~ 1.5 mm de cada extremidade de ambos os fios. Solde o lado do pino de um pino dourado em uma extremidade de cada fio, o mais próximo possível do copo. Use alicates para cortar o excesso de comprimento do pino além da junta de solda.
   2. Solde as outras extremidades dos fios AWG aos dois copos de solda centrais de um conector de microfita de 4 pinos.
   3. Dobre os cabos da cabeça do fio para cima em direção ao conector e coloque os pinos dourados contra o conector, paralelos entre si, conforme mostrado na Figura 2A. O pino conectado ao fio mais curto deve ser colocado abaixo do pino conectado ao fio mais longo. Use acrílico para unhas, cimento dental ou adesivo de cura UV para prender os cabos da tampa no lugar.

3. Uso

1. do dispositivo Implante os eletrodos do manguito para estimulação crônica do nervo vago.
   NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados com técnica estéril ou asséptica sob anestesia apropriada, de acordo com as Diretrizes do NIH (National Institutes of Health) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação local do IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais). Os procedimentos a seguir destinam-se a ilustrar um uso representativo do dispositivo e não pretendem ser abrangentes.
   1. Coloque o rato em uma estrutura estereotáxica e faça uma incisão sagital sobre os ossos parietal e occipital para revelar a superfície do crânio para implantação da tampa da cabeça/conector. Faça 4 furos no crânio com cuidado e coloque os parafusos do joalheiro. Use acrílico dental para prender a tampa da cabeça ao crânio e aos parafusos.
   2. Remova o rato da estrutura estereotáxica e coloque-o sobre o lado direito. Faça uma incisão vertical na pele do lado esquerdo do pescoço e disseque cuidadosamente o nervo vago esquerdo da artéria carótida, localizado entre os músculos esternomastóideo e esterno-hióideo e abaixo do músculo omo-hióideo.
   3. Tunelamente o manguito subcutaneamente em direção ao crânio. Conecte os cabos à tampa da cabeça usando os pinos dourados.
   4. Coloque o nervo vago dentro do manguito e prenda o dispositivo fechado amarrando um nó duplo nas suturas do manguito. Tenha cuidado para evitar danificar o nervo durante a implantação, manipulando o nervo com ganchos rombos e não condutores ou agarrando o tecido conjuntivo ao redor do nervo.
   5. Teste o implante aplicando estimulação ao dispositivo (trem de 10 s de pulsos bifásicos de 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs). A implantação adequada resultará na cessação da respiração e em uma queda no SpO₂ (Saturação Capilar Periférica de Oxigênio) de 5% ou mais.
   6. Cubra os pinos de ouro e as eletrodos expostas com acrílico dentário, feche as feridas com suturas e limpe os locais da incisão com solução salina, álcool e iodopovidona.
   7. Fornecer reposição de fluidos, analgésicos e cuidados pós-operatórios de acordo com as diretrizes do NIH e a aprovação da IACUC.
2. Estimule o nervo vago durante o comportamento acordado.
   NOTA: A entrega de VNS (Estimulação do Nervo Vago) à medida que os animais realizam tarefas motoras específicas demonstrou anteriormente expandir a representação do mapa motor da musculatura relevante para a tarefa. Usamos esse paradigma validado para fornecer um exemplo representativo do uso do dispositivo, mas muitos outros paradigmas comportamentais e/ou parâmetros de estimulação podem ser relevantes para aplicações alternativas. Os ratos foram treinados para serem proficientes na tarefa de pressionar a alavanca usada aqui antes da implantação do dispositivo. Após a cirurgia, o bom desempenho foi novamente verificado antes da entrega da VNS: os ratos realizaram pelo menos 100 tentativas bem-sucedidas em duas sessões de treinamento de 30 minutos por dia. O VNS foi emparelhado com pressionamentos de alavanca corretos durante 10 sessões de treinamento subsequentes ao longo de 5 dias.
   1. Conecte o rato a um gerador de estímulo por meio de uma tampa de cabeça implantada e ajuste para as configurações de estimulação apropriadas. Para a reorganização induzida por VNS do mapa cortical motor, emparelhe cada prensa de alavanca correta com um único trem de 15 pulsos bifásicos, cada um com largura de 100 μs e amplitude de 800 μA, entregues a uma frequência de 30 Hz.
   2. Um treinamento de estimulação é fornecido imediatamente após a detecção de cada pressionamento de alavanca bem-sucedido ao longo de dez sessões de treinamento de 30 minutos. Durante a administração do VNS, use um osciloscópio para monitorar a entrega bem-sucedida da estimulação de corrente.
3. Valide a função do manguito implantado cronicamente.
   1. Dentro de 24 h da última sessão de treinamento pareado com VNS, use microestimulação intracraniana (ICMS) para quantificar o mapa somatotópico funcional no córtex motor.
   2. Após a indução anestésica para mapeamento ICMS do córtex motor, validar novamente a função do balonete aplicando um trem de 10s de estimulação de corrente de 30 Hz, 0,8 mA (pulsos bifásicos de 100 μs), o que deve resultar em uma cessação da respiração e redução dos níveis de SpO₂ de pelo menos 5%, compatível com o reflexo de Hering-Breuer.
      NOTA: Dependendo da aplicação, a função do balonete pode ser considerada aceitável se for observada uma queda confiável de SpO₂ inferior a 5% ou se amplitudes de corrente mais altas (até 1,6 mA) produzirem de forma confiável uma redução de pelo menos 5% no SpO₂. A falha em observar uma cessação da respiração e/ou uma diminuição confiável na SpO₂ é indicativa de falha do implante.

Resultados

Figura 1: Montagem dos eletrodos do manguito de estimulação. (A) Depois de prender as suturas em ambos os lados do manguito, o fio Pt:Ir pode ser enfiado através da parede do manguito no orifício #1 (ponta de seta branca) usando uma agulha de...

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