Transferência gênica mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal do camundongo para estimulação auditiva induzida por luz

Resumo

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualização direta do núcleo coclear dorsal murino para estimulação optogenética da via auditiva. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra a transferência de genes mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal (DCN) de camundongos para permitir a estimulação auditiva induzida por luz. Um vetor viral que codifica opsina, um canal iônico sensível à luz, é injetado no DCN após uma craniotomia e aspiração cerebelar para acesso direto. As opsinas expressas permitem que os neurônios sejam ativados pela luz, fornecendo um modelo para estudar as respostas das vias auditivas usando optogenética.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Aspiração cerebelar

1. Usando uma sucção de 5 French, aspire a porção mais lateral do cerebelo esquerdo sobrejacente ao DCN até que o DCN seja visual (Figura 1, Painel Direito). Remova aproximadamente 1/4 a 1/3 do cerebelo esquerdo. O principal marco adjacente ao DCN é a ampola do canal semicircular superior.
   NOTA: A aspiração do cerebelo é a etapa fundamental do protocolo. A aspiração direcionada do cerebelo é realizada com mais sucesso se ocorrer em uma única tentativa e não com várias passagens de sucção, pois isso causará sangramento. Para auxiliar na aspiração, ajuste o plano focal do microscópio na profundidade esperada do NC, que será ligeiramente distal à superfície do cerebelo. Definir o plano focal para o CN melhorará a visualização e garantirá uma imagem nítida.
2. Após a aspiração, espera-se sangramento adicional, acúmulo de líquido cefalorraquidiano (LCR) e deslocamento do cerebelo na DCN. Instilar 0,5 cc de solução salina estéril rapidamente na craniotomia para evitar a coagulação do sangue. Uma combinação de toques suaves com um ponto dentário e sucção pode então ser usada para limpar um caminho para visualização direta do DCN. Não entre em contato diretamente com a superfície do DCN.

2. Microinjeção de pressão para transferência de genes mediada por vírus e recuperação cirúrgica

1. Depois que o DCN estiver livre de sangue e LCR sobrejacentes e for claramente visível, faça microinjeções de pressão no DCN usando uma seringa Hamilton de 10 μl durante um período de 2 minutos.
2. Introduza a agulha com um micromanipulador até que a ponta não seja mais visível sob a superfície do DCN.
3. Para um desempenho ideal, use uma agulha de calibre 33 ou 34 (use uma seringa estanque ao gás com a agulha de calibre 34) com um chanfro raso, como 45°, para minimizar o trauma contuso e localizar o volume de injeção dentro do DCN, que é uma estrutura fina e rasa do tronco encefálico (<300 μm de espessura).
   NOTA: Outros instrumentos de microinjeção podem ser utilizados. Idealmente, o instrumento de injeção deve ser flexível o suficiente para permitir uma leve flexão, se necessário, para atingir diretamente o DCN. Além disso, como o mouse se move ligeiramente durante o procedimento devido à respiração, o instrumento deve ser robusto o suficiente para suportar pequenas quantidades de movimento.

3. Recuperação cirúrgica

1. Imediatamente após a injeção, aproxime novamente a pele e permita que o camundongo se recupere de acordo com o procedimento de recuperação padrão. O cerebelo restante e o tecido cicatricial preencherão a cavidade causada pela aspiração do cerebelo. Monitore constantemente os animais até que a consciência seja recuperada o suficiente para manter a decúbito esternal. Monitore a frequência cardíaca, a frequência respiratória, bem como a capacidade de se alimentar.
   NOTA: Nenhum animal que tenha sido submetido a cirurgia é devolvido a uma gaiola com outros animais até que esteja totalmente recuperado.
2. Se um camundongo começar a andar em círculos no pós-operatório (<5% dos casos), normalmente 2-4 horas após o fechamento da incisão na pele, sacrifique imediatamente o camundongo, pois provavelmente teria dificuldade em se alimentar. Este efeito colateral é provavelmente devido à aspiração do cerebelo. O animal deve ser monitorado quanto à dor no pós-operatório, e narcóticos apropriados devem ser administrados para garantir o conforto do animal com base nos padrões institucionais. Antibióticos podem ser necessários, se houver evidência de infecção.

Resultados

Figura 1: A aspiração cerebelar parcial demonstra acesso ao núcleo coclear dorsal. Painel esquerdo: Depois que o mouse é colocado no suporte, uma incisão é feita verticalmente através da pele e do tecido mole ao longo da face posterior do crânio...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte estereotáxico	Stoelting	51500
5 Sucção francesa	Simetria Cirúrgica	2777914
Dental Pontos	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 μl Seringa Hamilton	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Ferramentas Cirúrgicas Finas Rongeurs		16021-14