Estimulação do nervo vago em um modelo de rato para reduzir o comportamento de congelamento

Resumo

Fonte: Childs, J. E., et al. Estimulação do nervo vago como ferramenta para induzir plasticidade em vias relevantes para o aprendizado da extinção. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o método de estimulação do nervo vago (VNS) em um modelo de rato para reduzir o comportamento de congelamento. Ratos condicionados ao medo recebem VNS durante a reexposição ao som, levando à redução do congelamento e revelando seu potencial terapêutico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Condicionamento do Medo Auditivo

NOTA: Este protocolo de condicionamento do medo é mais intensivo do que a maioria porque o objetivo desses experimentos é aumentar a extinção. Com um leve condicionamento de medo que é facilmente extinto, um efeito de piso pode obscurecer esse aprimoramento.

1. Animais domésticos em um ciclo claro/escuro de 12 horas com acesso ad libitum a comida e água. Manuseie os animais diariamente durante a recuperação da cirurgia.
2. Montar o aparelho de condicionamento e teste, consistindo de uma caixa operante alojada em uma câmara atenuada de som (Figura 1C). A caixa operante tem paredes de plástico transparente, 20 x 20 x 20 cm, e tem um piso de grade de aço inoxidável, que é conectado a um gerador de choque de pé. Use uma luz de casa branca para iluminar a câmara para gravação de vídeo. Use um tom de nível de pressão sonora (NPS) de 9 kHz e 85 dB como estímulo condicionado (CS).
3. Registre o comportamento usando uma câmera digital localizada dentro da câmara acima da caixa operante. Visualize e monitore a sessão em um computador localizado fora da sala de comportamento. Salve vídeos para análise posterior.
4. Limpe as câmaras com etanol 70% antes e depois de cada sessão para eliminar sinais olfativos.
5. Condição de medo dos ratos por 2 dias (Figura 2A). Confirme se os ratos não têm medo inato do tom apresentando 5 tons (9 kHz, 85 dB, 30 s) no primeiro dia. Certifique-se de que os níveis de congelamento sejam insignificantes.
   1. Siga as apresentações iniciais de tons com 8 pares de tons e footshock (1 s, 0,5 mA) em cada um dos 2 dias consecutivos. Repita os pares de tom e choque novamente no segundo dia. Varie o intervalo entre estímulos (ISI) entre 2 e 4 min, com média de 3 min para cada tentativa. Randomize o ponto em que o choque ocorre durante o tom.
6. No terceiro dia, teste a força da associação tom / choque. Toque 4 tons com um ISI de 3, 4 ou 5 min (média de 4 min) na ausência de choques nas patas e registre o comportamento de congelamento dos animais durante as apresentações de tons e durante os intervalos entre estímulos como medidas da resposta ao medo condicionado (CFR).
7. No dia 4, comece o treinamento de extinção com estimulação do nervo vago (VNS) ou VNS simulado.
   1. Conecte os ratos ao estimulador inserindo os conectores machos do estimulador no local de entrada de estimulação. Coloque os animais na câmara (Figura 1A, 1C). Defina o estimulador para 0,4 mA, largura de pulso de 500 μs a 30 Hz. Defina a estimulação para uma duração total de 30,15 s, começando 150 ms antes do início do tom. Jogue animais 4 tons e emparelhe cada apresentação de tom com VNS ou VNS simulado.
8. Teste periodicamente a integridade elétrica do manguito e do local de entrada usando um osciloscópio.
   1. Conecte o animal normalmente e divida a saída do estimulador para o osciloscópio.
   2. Defina a faixa no osciloscópio como -20 V a +20 V e execute a estimulação. A forma de onda da estimulação de 30 Hz deve ser visível no osciloscópio. Estímulos superiores a 10 V de tamanho indicam alta impedância e um manguito ou conexão funcionando incorretamente no local de entrada da estimulação.
9. Para testar o efeito do VNS no treinamento de extinção, execute um segundo teste CFR no dia 5. Registre o tempo gasto congelando durante as apresentações de tons e compare-o com o congelamento da linha de base registrado durante o primeiro teste de CFR.
10. Analise os vídeos usando um observador independente que desconhece as condições de tratamento. Meça o tempo gasto congelando durante apresentações de tom usando um cronômetro. O congelamento é definido como imobilidade completa, durante a qual o rato exibe respiração rápida, cabeça abaixada e patas abertas. A análise do comportamento de congelamento pode ser dividida em duas fases: durante a apresentação do tom e durante o intervalo entre estímulos.

Resultados

Figura 1. Estimulação do nervo vago e configuração experimental. (A) Esquema da configuração usada para VNS. Os animais são conectados a uma unidade de isolamento de estimulação por meio de uma touca a partir da qual 2 fios de platina-irídio conduzem subc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Betadine	Henry Schein	69066950
Câmera digital - Logitech webcam C210	Logitech	B003LVZO88
Platinum iridium wire	Medwire	10IR9/49T
Estimulador de pulso isolado modelo 2100	A-M Systems	Rolamento 720000
Osciloscópio de canal único de 10 MHz Cinômetro		CQ5010C
Extech 407730 Medidor de nível de som digital de 40-130 decibéis	Extech Instruments	B000EWY67W
DSCK-C de saída dupla, choque embaralhado	Kinder Scientific Co