Regeneração axonal no nervo ciático de um camundongo após uma lesão por esmagamento

Resumo

Fonte: Li, Q., et al. Investigando a regeneração do axônio de mamíferos: eletroporação in vivo do gânglio da raiz dorsal de camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o processo de regeneração axonal em um nervo ciático de camundongo após uma lesão por esmagamento. O nervo isolado é fixado e preparado para imagens, com proteínas fluorescentes expressas em neurônios para visualizar o crescimento do axônio. Usando um microscópio de epifluorescência, a regeneração do axônio é rastreada a partir do local da lesão para avaliar a extensão do crescimento.

Protocolo

1. Materiais e Reagentes

1. Animais
   1. Use camundongos CF1 fêmeas de seis semanas pesando 30–35 g para os experimentos.
      NOTA: Os camundongos foram alojados em grupo (5 camundongos por gaiola) em gaiolas esterilizadas ventiladas individualmente com cama de espiga de milho de 1/4" e ninhos quadrados de 2" para nidificação. As gaiolas foram mantidas em um ciclo claro-escuro controlado de 12 h e a temperatura ambiente estava entre 19,4 °C e 25 °C. Os camundongos foram alimentados com uma dieta global de roedores e sistema automático de abastecimento de água.
2. Instrumentos
   1. Use os seguintes instrumentos cirúrgicos para conduzir a cirurgia com eficiência: seringas descartáveis (27 G, 1,0 mL) para injeção intraperitoneal, cortador de pele, microscópio de dissecção estéreo, pinça de microcirurgia, tesoura de microcirurgia e rongeurs de ossos pequenos e esponjas não tecidas esterilizadas.
      NOTA: Todos os instrumentos e materiais são autoclavados antes da cirurgia ou pré-esterilizados pelos produtores. Durante a cirurgia, os instrumentos são pulverizados com álcool 75% para manter a esterilidade.
3. Soluções anestésicas
   1. Use a solução anestésica #1 para induzir a anestesia e use a solução anestésica #2 antes da injeção dos gânglios da raiz dorsal (DRG) para manter a anestesia.
      1. Para fazer a solução anestésica #1, dilua a cetamina e a xilazina em solução salina estéril na concentração final de 10 mg/mL e 1,2 mg/mL.
      2. Para fazer a solução anestésica #2, diluir avertin em solução salina estéril na concentração final de 20 mg/mL.
4. Plasmídeo de DNA e RNA Oligos
   1. Prepare os plasmídeos usando o kit comercial seguindo os protocolos do fabricante de acordo. Diluir os DNAs do plasmídeo em água deionizada estéril até a concentração de 2,0 μg/μL.
   2. Adicione a solução de corante Fast Green para atingir uma concentração final de 0,005–0,01% (v/v) para melhor visualização do contorno do DRG durante a injeção.
   3. Dissolva o pequeno RNA interferente (siRNA) ou oligonucleotídeos de microRNA (oligos de microRNA) nos tampões correspondentes fornecidos pelos fabricantes para atingir uma concentração final de 50 μM.
5. Pipeta de microinjeção
   1. Puxe o vidro capilar usando o extrator de micropipeta e corte a ponta da pipeta de vidro capilar puxada com uma tesoura de microcirurgia para gerar uma abertura com um diâmetro externo de aproximadamente 50 μm. Em seguida, esterilize a pipeta de vidro sob luz ultravioleta em uma bancada limpa por aproximadamente 20 a 30 minutos.
   2. Monte a pipeta de vidro esterilizado no porta-pipetas conectado a um sistema de dosagem de microinjeção intracelular. Defina os parâmetros do sistema de microinjeção em 30 psi de pressão e 8 ms de duração.
6. Sistema de eletroporação
   1. Conecte os eletrodos ao sistema de eletroporação de onda quadrada e defina os seguintes parâmetros: pulsos de 15 ms a 35 V com intervalos de 950 ms para eletroporação in vivo.
7. Solução de perfusão e fixação
   1. Dissolva o pó de paraformaldeído (PFA) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 4% (p/v). Conservar a solução de PFA a 4 °C.

2. Procedimentos Experimentais

1. Exposição Cirúrgica dos DRGs L4 e L5
   1. Anestesiar o camundongo com injeção intraperitoneal da solução anestésica #1 preparada anteriormente (com cetamina 100 mg/kg de peso corporal e xilazina 12 mg/kg de peso corporal).
   2. Raspe a área cirúrgica com o cortador de pelos.
      OBS: Como haverá outra cirurgia para o esmagamento do nervo ciático esquerdo, o pelo da coxa posterior esquerda pode ser raspado simultaneamente.
   3. Coloque o mouse sobre o cobertor aquecido (35.0 ° C) e monitore a temperatura retal com uma sonda de temperatura.
   4. Para testar a anestesia, aperte os dedos dos pés e a cauda do camundongo e observe as respostas comportamentais.
   5. Cole os quatro membros do rato no quadro de cortiça.
   6. Limpe a área cirúrgica com uma solução de iodóforo e, em seguida, use álcool 75% para remover o iodóforo antes de cortar a pele.
   7. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   8. Antes da incisão, marque os dois lados das cristas ilíacas com um marcador fino. Desenhe uma linha conectando os dois pontos das cristas ilíacas para facilitar a identificação das posições dos DRGs L5.
   9. Faça uma incisão de 3 cm ao longo da linha média da região lombar com uma microtesoura. Além disso, descole os músculos paraespinhosos, como o músculo multífido e o músculo longíssimo lombar, dos processos espinhosos L3 a S1 e exponha as articulações facetárias de L4-5 e L5-6.
   10. Use um micro-rongeur para remover as articulações facetárias de L4-5 e L5-6. Além disso, remova o arco neural esquerdo de L4 e L5 para expor o lado dorsal dos DRGs.
2. DRG Injection
   1. Injete uma solução anestésica #2 (com avertin 200 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal para manter a anestesia antes da injeção de DRG.
   2. Carregue os plasmídeos de DNA ou oligos de RNA (1 μL por DRG) na pipeta capilar de vidro.
   3. Insira a ponta da pipeta de vidro capilar cuidadosamente no DRG.
   4. Injete gradualmente 1,0 μL de solução de plasmídeos de DNA ou oligos de RNA no DRG usando os sistemas de distribuição de microinjeção intracelular (30 psi, 8 ms).
      NOTA: A duração da injeção não deve durar menos de 5 minutos.
3. Electroporation
   1. Solte PBS nas pontas dos eletrodos.
   2. Limpe o sangramento com gaze de algodão quadrada esterilizada.
   3. Aperte suavemente o DRG alvo com os eletrodos e aplique 5 pulsos elétricos quadrados com o sistema de eletroporação.
   4. Feche as camadas muscular e cutânea, respectivamente, com suturas de nylon 5-0.
   5. Coloque o camundongo em um cobertor aquecido (35,0 ° C) sob muita atenção até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o mouse para a gaiola inicial depois que ele estiver totalmente recuperado da anestesia.
      NOTA: Leva aproximadamente 60 minutos para o mouse se recuperar completamente da anestesia no cobertor a 37 °C. Dissolva uma pílula (200 mg) de ibuprofeno em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.
4. Crush do nervo ciático
   1. Dois ou três dias (dependendo do desenho experimental) após a eletroporação do DRG, anestesiar o camundongo por via intraperitoneal com solução anestésica #2 (com avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Cole os quatro membros do rato no quadro de cortiça.
   3. Faça uma incisão de 1 cm 0,5 cm para o lado esquerdo ao longo da linha média. Corte os músculos, como o músculo glúteo máximo e o músculo piriforme, longitudinalmente. Exponha o segmento do nervo ciático entre o forame isquiático maior e a incisura ciática.
   4. Esmague o nervo com uma pinça de microcirurgia por 12 s e marque o local do esmagamento com uma sutura epineural de náilon 10-0. Faça um nó na membrana dural para marcar o local do esmagamento.
   5. Feche as camadas muscular e cutânea com sutura de nylon 5-0.
   6. Coloque o rato sobre uma manta aquecida (35,0 °C) com muita atenção até que tenha recuperado completamente a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Retorne o mouse para a gaiola inicial depois que ele estiver totalmente recuperado da anestesia.
      NOTA: Leva aproximadamente 60 minutos para o mouse se recuperar completamente da anestesia no cobertor a 37 °C. Dissolva uma pílula (200 mg) de ibuprofeno em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.
5. Perfusão de camundongos, DRG e colheita do nervo ciático<ol style='list-style-type:decimal;'>
6. Dois ou três dias após o esmagamento do nervo ciático (dependendo do desenho experimental), anestesiar o camundongo por via intraperitoneal com solução anestésica #2.
7. Perfunda o camundongo transcardialmente com PBS (pH 7,4) seguido de paraformaldeído (PFA) a 4% gelado (pH 7,5) em PBS.
8. Após a perfusão, separe cuidadosamente os DRGs junto com as raízes nervosas e o nervo ciático antes do joelho com microtesouras e micropinças sob o microscópio de dissecção. Coloque o nervo ciático diretamente em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C.

Imagem e medição dos axônios sensoriais marcados com fluorescência

1. Retire o tecido e a membrana anexados no nervo ciático fixo com microtesouras e micropinças cuidadosamente sob o microscópio de dissecação. Em seguida, troque o PFA a 4% por PBS e lave o nervo três vezes.
2. Coloque o nervo ciático em uma lâmina e mantenha-o reto. Adicione 80 μL de solução antidesbotante ao redor do nervo e, em seguida, coloque uma lamínula sobre ele. Achate todo o tecido montado com pressão.
3. Coloque os tecidos achatados no microscópio epifluorescente invertido equipado com um acessório para aquisição de mosaico e processamento de imagens.
   NOTA: Os comprimentos de excitação e emissão são 488 nm e 509 nm. Também é possível pegar várias imagens sobrepostas manualmente e unir as imagens usando o ImageJ com o plug-in Mosaic.
4. Ao medir o comprimento dos axônios regenerados, rastreie todos os axônios marcados com fluorescência identificáveis no nervo ciático desde o local do esmagamento (marcado com a sutura epineural 10-0) até as extremidades distais do axônio.

Materiais