Entrega de medicamentos direcionados em um modelo de camundongo via injeção de cisterna magna

Neste artigo

Resumo

Fonte: Zamboni, M., et al., Indução de modificação de células leptomeníngeas via injeção intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o procedimento de administração de um medicamento indutor na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A injeção induz seletivamente a expressão de marcadores fluorescentes em células da superfície cerebral acessíveis via líquido cefalorraquidiano, confirmado por imagens de fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Posicionamento do animal para o procedimento

Fixe a cabeça do animal no suporte da cabeça. Para melhorar a acessibilidade à cisterna magna, posicione o corpo do animal a aproximadamente 30° da superfície da mesa e a cabeça inclinada para baixo, para estabelecer um ângulo de 120° com o resto do corpo e estenda a nuca para facilitar o acesso à cisterna magna (Figura 1A).
Adicione toalhas de papel embaixo do animal para apoiar seu corpo durante todo o procedimento.
Garanta a administração da anestesia através do bocal e reduza a concentração de isoflurano para 2,5% e a entrega de ar para 200 ml/min.
Aplique pomada oftálmica.

2. Exposição da Cisterna Magna

Raspe a nuca do animal e higienize a área com etanol 70% e Betadine.
Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão na linha média (cerca de 7 mm de comprimento) começando no nível do osso occipital e estendendo-o posteriormente.
Separe suavemente o tecido conjuntivo superficial e os músculos do pescoço, puxando lateralmente a partir da linha média com uma pinça de ponta fina. Isso irá expor a membrana dural que cobre a cisterna magna, em forma de triângulo invertido.
Use lanças de absorção estéreis ou cotonetes para controlar qualquer sangramento resultante.
Posicione um pequeno separador cirúrgico para manter os músculos do pescoço afastados e permitir a visualização da cisterna magna durante todo o procedimento.

3. Injeção intracisternal

Para obter acesso à cisterna magna, identifique a extremidade caudal do osso occipital e insira a agulha que foi previamente dobrada imediatamente abaixo.
NOTA: Haverá uma queda repentina na resistência à medida que a membrana dural for perfurada. No entanto, a ponta da agulha penetrará apenas ligeiramente abaixo da superfície meníngea, graças à sua forma em forma de gancho.
Uma vez perfurada a dura-máter, deixe a ponta dobrada da agulha penetrar por baixo da superfície dural, puxando suavemente a seringa para cima e paralelamente ao corpo do animal, a fim de "enganchar" a agulha no crânio (ver Figura 1B). Isso garantirá melhor estabilidade e evitará que a agulha penetre mais profundamente, evitando assim o risco de danificar o cerebelo ou medula subjacente.
Injete o composto lentamente para evitar interferência no fluxo natural do líquido cefalorraquidiano.
NOTA: Dependendo do objetivo do experimento, a taxa de infusão pode variar. Se for necessária uma taxa de infusão lenta e constante (por exemplo, ao usar o procedimento para rastrear o movimento do líquido cefalorraquidiano), pode ser aconselhável usar um sistema de microinfusão automatizado em combinação com a seringa.
Após a injeção, deixe a agulha descansar no local por 1 minuto e remova-a com cuidado. Use uma pinça de ponta fina para auxiliar na retração da agulha de sua posição em forma de gancho.
NOTA: O uso de uma agulha fina (por exemplo, 30 G) não leva a danos substanciais à membrana meníngea e consequente saída do líquido cefalorraquidiano. Se forem necessários tamanhos de agulha maiores, recomendamos interromper o vazamento de fluido aplicando pressão no local da injeção usando uma ponta de algodão estéril.

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Resultados

Figura 1: Marcação específica de células leptomeníngeas por injeção intracisternal de endoxifeno. Os painéis A e B ilustram o procedimento desenvolvido para administração intracisternal. Para ter acesso à ci...