Transplante Estereotáxico de Suspensão de Células Neurais em um Camundongo com Lesão Cerebral Traumática

Resumo

Fonte: Furmanski, O., et al. Modelo de Impacto Cortical Controlado de Lesão Cerebral de Camundongo com Transplante Terapêutico de Células Neurais Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, células neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos são injetadas estereotaxicamente na borda da substância cinzenta e da substância branca do córtex profundo em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática. As células transplantadas se integram ao tecido, promovendo a recuperação funcional e o reparo do circuito no cérebro lesionado.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Transplante estereotáxico de suspensão celular

1. Inicie o procedimento de transplante de células aproximadamente 24 horas após a craniectomia.
2. Prepare o equipamento de transplante de células e suprimentos cirúrgicos
   1. Encha uma seringa de ponta deslizante de 1 mL com solução salina estéril para irrigação de feridas. Coloque uma agulha de 25 G na seringa para controlar a irrigação.
   2. Encha uma seringa de ponta deslizante de 1 mL com solução de CsA (ciclosporina A) para imunossupressão. Coloque uma agulha de 25 G ou maior na seringa de CsA. Reabasteça a seringa CsA conforme necessário entre as cirurgias.
   3. Prepare agulhas de vidro a partir de pipetas capilares de vidro de borossilicato de 1,0 mm OD (diâmetro externo) usando métodos padrão.
   4. Use uma pinça fina para quebrar as pontas da agulha com aproximadamente 200 μm de diâmetro. Certifique-se de que a haste cilíndrica da agulha não tenha mais de 2.5 cm.
3. Calibre a bomba de seringa para uso com uma seringa de 10 μL. Insira uma taxa de fluxo de 0,2 μL/min para fornecer um volume total de 2,0 μL.
4. Prepare a suspensão de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC).
   1. Execute todo o manuseio de células em uma capa de cultura de células BSL-2 (nível de biossegurança 2) usando técnicas padrão de manuseio estéril.
   2. Prepare as culturas de células com antecedência de acordo com as condições padrão definidas para o tipo de célula.
      NOTA: Os experimentos mostrados nesta demonstração usaram várias células de fenótipo neural derivadas de hiPSCs.
   3. Dissocie suavemente as células em uma suspensão de célula única usando uma solução de descolamento celular ou outro meio enzimático ou químico preferido.
   4. Conte as células em suspensão e, em seguida, dilua a suspensão para 5 x 10⁴ células/μL em meio de cultura celular mínimo (por exemplo, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)) em um tubo de ensaio flip top de 1,7 mL.
   5. Observe as seguintes notas para transplante:
      1. Manter as células em suspensão a 37 °C durante os procedimentos.
      2. Carregue a seringa apenas imediatamente antes de realizar a injeção intraparenquimatosa
         NOTA: Se a suspensão celular for colocada de lado, a gravidade pode fazer com que ela se assente ou grude na lateral da seringa, levando a irregularidades no número de células injetadas.
      3. Colocar ~ 5 x 10⁵ células (suspensão de 10 μL) por camundongo se realizar procedimentos de transplante de células múltiplas em um dia.
5. Realize a cirurgia de transplante estereotáxico
   1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia conectada a um vaporizador de isoflurano com uma fonte de oxigênio comprimido. Induza a anestesia com ~ 3% de isoflurano a ~ 0,7 L / min de oxigênio.
   2. Coloque o mouse em uma estrutura estereotáxica com um cone nasal anestésico anexado.
      1. Fixe a cabeça no lugar com barras auriculares e uma barra de mordida, orientando a cabeça de forma que o osso frontal do crânio fique horizontal. Mantenha a anestesia a 1,5% - 2% de isoflurano durante a cirurgia.
   3. Realize cuidados pré-operatórios e preparação asséptica
      1. Aplique pomada oftálmica hidratante contendo antibióticos nos olhos usando um cotonete.
      2. Lave o local da incisão com solução salina estéril para limpar o local e afrouxar as suturas. Aplique suavemente etanol 70% com um cotonete para esterilizar o local da incisão.
   4. Remova as suturas usando pinças finas e tesouras oftálmicas. Irrigue o local da cirurgia e a craniectomia com solução salina estéril abundante.
      1. Se o córtex apresentar características desqualificantes, como hérnia excessiva, descoloração, vascularização interrompida ou hemorragia, o animal deve ser excluído.
   5. Carregar a seringa de transplante de células
      1. Mover a suspensão de células da incubadora a 37 °C para uma cobertura de biossegurança para cultura de células. Gire suavemente ou bata no tubo para garantir uma suspensão celular homogênea.
      2. Use um micropipetador para carregar a suspensão de células de ~ 7.5 μL na seringa Hamilton através da extremidade do êmbolo.
         1. Segure a seringa em um ângulo de ~120° com a extremidade do êmbolo voltada para baixo. Insira o êmbolo, tomando cuidado para não introduzir uma bolha de ar entre a suspensão e a ponta do êmbolo.
      3. Conecte o conjunto da junta à agulha da pipeta e, em seguida, conecte a agulha à seringa.
      4. Empurre o êmbolo para mover a suspensão da célula para dentro da agulha da pipeta. Se houver resistência contra o fluxo de saída da suspensão, use uma pinça fina para quebrar a ponta da agulha para aumentar o diâmetro.
   6. Encaixe a seringa na bomba de seringa estereotáxica. Avance o êmbolo para certificar-se de que o conjunto da bomba da seringa está funcionando corretamente.
   7. Mova a agulha para as coordenadas para injeção.
      1. Alinhe a ponta da agulha com bregma. Defina as coordenadas X e Y como 0. Em seguida, mova a ponta da agulha sobre a craniectomia para 2,0 mm lateral e -1,0 mm posterior à bregma. Toque a ponta da agulha na superfície da dura-máter e ajuste a coordenada estereotáxica para Z = 0.
      2. Empurre o êmbolo para garantir que a suspensão celular esteja fluindo adequadamente antes de introduzir a agulha no cérebro.
      3. Introduza a agulha no cérebro a uma profundidade de Z = -1,4 mm. Essas coordenadas estereotáxicas colocam o enxerto na borda da substância cinzenta e da substância branca do córtex profundo.
   8. Ligue a bomba da seringa para infundir a suspensão celular. Defina o cronômetro da bancada do laboratório para 15 minutos e inicie o cronômetro. Use um microscópio de longa distância de trabalho para monitorar o fluxo de saída da suspensão celular.
      1. Irrigue o local da cirurgia com solução salina estéril durante a injeção para manter a hidratação do tecido.
      2. Aos 15 minutos, retire lentamente a agulha de transplante. Irrigue o local da cirurgia com soro fisiológico e feche a incisão com suturas.
   9. Realize cuidados pós-operatórios
      1. Interrompa a anestesia. Administre CsA por injeção subcutânea na nuca na dose de 10 mg / kg. Coloque o mouse em uma gaiola pós-operatória limpa e pré-aquecida.
      2. Forneça analgésico de paracetamol na água potável a 1,0 mg/mL.
         NOTA: Forneça analgesia de acordo com o protocolo operacional padrão (SOP) apropriado do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e levando em consideração as variáveis de resultados experimentais.
      3. Forneça uma gaiola de recuperação de alimentos umedecida para ajudar na reidratação e recuperação.
6. Continue as injeções diárias de CsA a 10 mg / kg durante toda a duração da sobrevivência do camundongo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ml seringas	Becton Dickinson (BD)	309659
ensaio flip top de 1,7 ml Seringa	Denville	C2170
10 microlitros	Hamilton	7635-01
25G Agulhas de seringa Precision Glide	Becton Dickinson (BD)	305122
70% Etanol			Produto de escolha; varia de acordo com a região
Paracetamol suspensão oral	Tylenol (Infantil)		Diluir para 1 mg/ml em água
Vaporizador anestésico	Vetland	0521-11-22
Pano		de manuseio de animais	Compre na loja de departamentos
Betadine	Purdue Products	NDC-67618-151-32
Oxigênio			Produto de escolha; varia de acordo com a região
Ciclosporina A	Sigma-Aldrich	30024-100mg
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-500ml
DMEM	Invitrogen (ThermoFisher)	A14430-01
Fita isolante	3M Corporation		Compre em lojas de departamentos
Pinças finas	Ferramentas de Belas Ciências	11254-20
Fórceps	Ferramentas de Ciências Finas	91106-12
Pipetas capilares de vidro, 1 mm OD, 0,58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-3
Kit de micromotor rotativo de alta velocidade	Foredom Electric Co.	K.1070 - K.107018
Conjunto de 5 Rebarbas Micro Ideal Cell	Point Scientific	60-1000
Impact One Impactor Estereotáxico para CCI	Leica Biosystems	39463920
Isoflurano	Temporizadores de bancada de laboratório Baxter	NDC-10019-360-60
	Micropipeta Fisher Scientific	14-649-17
extrator	MicroData Instruments, Inc.	PMP-102	Qualquer extrator será suficiente
Lamínulas de microscópio	Fisherbrand	12-545-E
Meio			de montagem de lâminas de microscópio Produto de escolha
Espelho			Compre de loja de departamentos
Porta-agulhas hemostático	Ferramentas de Belas Ciências	12002-12
Oftálmico pomada	Falcon Pharmaceuticals	NDC-61314-631-36
Tesoura de mola oftálmica	Fine Science Tools	15018-10
Caixa			Compra de loja de departamentos
Cilindro			Compra de loja de departamentos
Bomba de seringa motorizada QSI	Stoelting	53311
Encaixe de compressão de agulha removível	Hamilton	55750-01
Quadro estereotáxico para roedores pequenos	Stoelting	51925
Tesoura pequena	Fine Science Tools	14060-09
StemPro Accutase	Invitrogen (ThermoFisher)	A1110501
Almofadas de preparação de álcool estéril	Fisherbrand	06-669-62
Cotonetes estéreis/Pontas Q Kendall	Tyco Healthcare	540500
Solução salina estéril	Hospira	NDC-0409-1966-07
Cronômetros (2)	Fisher Scientific	06-662-56
Superfrost Plus Gold	Suturas Fisherbrand	15-188-48
- seda 5.0 com agulha curvada	Oásis	MV-682

1 tubos de de comprimido de plástico de plástico Lâminas de microscópio