Transdução lentiviral de células progenitoras neurais para regulação epigenética da expressão de alfa-sinucleína

Resumo

Fonte: Tagliafierro, L., et al. Plataforma de vetor lentiviral para a entrega eficiente de ferramentas de edição de epigenoma em modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a transdução lentiviral de células progenitoras neurais (NPCs) para modificação epigenética direcionada da alfa-sinucleína, uma proteína-chave na doença de Parkinson. O protocolo permite a metilação do DNA mediada por metiltransferase, reduzindo a expressão de SNCA para estudar a regulação gênica e possíveis intervenções terapêuticas.

Protocolo

1. Diferenciação de células progenitoras neurais dopaminérgicas

1. Descongelando NPCs MD (células progenitoras neurais dopaminérgicas do mesencéfalo)
   1. Prepare uma placa revestida com BMM (membrana de matriz básica) e aqueça o N2B27 completo. Adicione 10 mL de DMEM/F12 quente a um tubo cônico de 15 mL. Colocar um criovulgo num bloco de calor a 37 °C durante 2 min.
      1. Transferir as células do criogénio para o tubo que contém DMEM/F12. Centrifugue a 300 x g por 5 min.
      2. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as células em 2 mL de N2B27 e adicione a suspensão celular a um poço da placa revestida com BMM. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂.

2. Transdução de NPCs MD e análise das alterações de metilação

1. Transdução de NPCs MD
   1. Transduza NPCs MD em 70% de confluência com vetores LV (vetor lentiviral)-guia RNA/Cas9-DNMT3A desativado (enzima DNA metiltransferase 3A) em MOI (multiplicidade de infecção) = 2. Substitua o meio N2B27 16h pós-transdução.
   2. Adicionar N2B27 com 5 μg/ml de puromicina, 48 h após a transdução. Cultive as células por 3 semanas em N2B27 mais puromicina para obter as linhas MD NPC estáveis. As células estão prontas para aplicações downstream (DNA, RNA, análises de proteínas, caracterização fenotípica, congelamento e passagem).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
15 mL tubos de centrífuga cônicos	Corning	430791
placas de 6 poços	Corning	3516
Allegra 25R centrífuga de mesa	Beckman Coulter	369434
Microscópio de fluorescência invertida	Leica	DM IRB2
Reagentes
Solução antibiótica-antimicótica, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
B-27 Suplemento (50X), menos vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	08-774-552
DMEM-F12	Lonza	12-719
N-2 Suplemento (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502001
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049

de cultura de células