Transdução viral in utero em camundongo

Resumo

Fonte: Lutz, D., et al. Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural após transdução in utero do cérebro e da medula espinhal de camundongos em desenvolvimento. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a transdução viral via injeção intra-uterina em embriões de camundongos. Uma rata grávida é preparada para a cirurgia e uma incisão na linha média é feita para expor os cornos uterinos. Uma mistura de um vírus contendo o gene desejado e um corante de rastreamento é injetada nos embriões dentro dos sacos uterinos nos locais-alvo. Os chifres uterinos são então colocados de volta antes da sutura.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Transdução In Utero

:

1. Prepare o vírus adeno-associado tipo 1 (AAV1) que codifica para o alvo desejado (4 x 10,¹¹ partículas virais/μL de AAV1) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4. Adicione 0,1 mg/μL Fast Green e mantenha a mistura AAV1-Fast-Green a 37 °C.
2. Prepare uma ponta capilar fina com a forma desejada (8 mm de comprimento, com um diâmetro externo de 80 μm e um diâmetro interno de 50 μm) usando um extrator de micropipeta (configurações: pressão = 500, calor = 700, tração = 0, velocidade = 80, tempo = 200, consulte a Tabela de Materiais). Quebre a ponta do capilar para que fique 4-5 mm.
3. Monte um tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) com a ponta capilar e aspire 15 μL da mistura AAV1-Fast-Green no capilar.
4. Manter os animais sujeitos a uma temperatura corporal fisiológica constante de 37 °C durante todo o procedimento.
5. Coloque um camundongo C57Bl / 6 prenhe (dia embrionário 14,5) na câmara de pré-incubação e anestesie o camundongo com isoflurano gasoso a 4% (com uma taxa de fluxo de ar volumétrico de 0,6-0,8 L / min).
6. Por via subcutânea, injete buprenorfina (0,1 mg/kg de peso corporal).
7. Coloque o mouse anestesiado na placa cirúrgica pré-aquecida (37 °C).
8. Cubra os olhos com um lubrificante.
9. Encaixe o mouse com a máscara de anestesia (isoflurano gasoso a 1,5% a uma taxa de fluxo de ar volumétrico de 0,6-0,8 L/min) na placa cirúrgica e raspe a região da pele abdominal. Limpe a região raspada com etanol 3X 75% e depois com solução de betadina.
   NOTA: Monitore continuamente o comportamento respiratório do camundongo anestesiado. Ajustar a concentração do gás isoflurano de acordo com o padrão de inalação-exalação do ratinho.
10. Verifique a ausência do reflexo plantar apertando as falanges da pata traseira do camundongo.
11. Abra a cavidade abdominal segurando a pele com pinça de íris serrilhada curva (10 cm) e cortando a pele ao longo da linha mediana com uma tesoura reta de carboneto de tungstênio (10 cm) e, em seguida, segurando a parede peritoneal com uma pinça reta de Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0,12 mm) e cortando a parede ao longo da linha alba com uma tesoura reta de Vanna (8 cm).
12. Coloque um pedaço de filme de parafina fenestrada na abertura abdominal e fixe o filme em ambas as extremidades com pinça hemostática de micro-mosquito (12,5 cm, curva).
13. Exponha os chifres uterinos com um dispositivo semelhante a uma colher para evitar danos aos embriões dentro dos chifres uterinos. Goteje algumas gotas de PBS (37 ° C) nos cornos uterinos e inspecione os embriões quanto a danos ou malformações dentro do saco uterino.
14. Documente a ordem e a posição dos embriões nos cornos uterinos. Vire os embriões cuidadosamente dentro do saco uterino até atingir a posição desejada para a injeção.
15. Injete 1-2 μL da mistura AAV1-Fast-Green inspecionando visualmente o local da injeção (por exemplo, ventrículos cerebrais) e a penetração do corante sob um estereomicroscópio.
16. Documente os embriões injetados e coloque os cornos uterinos com os embriões injetados de volta na cavidade abdominal.
17. Goteje algumas gotas de PBS (37 ° C) na cavidade abdominal. Feche a cavidade suturando a parede peritoneal (use pontos de poliamida tamanho 6-0) e a pele (use pontos de poliamida tamanho 3-0) usando pinça hemostática de mosquito de Halsted (12,5 cm, curva). Como alternativa, use um padrão simples interrompido ou sutura/grampos de aço inoxidável para fechar a cavidade abdominal e a pele.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
26Gx 1'' agulha	Henke-Sass, Wolf GmbH
410 Unidade de Anestesia para bomba de ar	Biomedical Instruments (Univentor)	8323102
Vírus adeno-associado sorotipo 1 (AAV1)	UKE (Viral Core Facility)	-	Para referências e áreas-alvo de AAV1, consulte: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ e também: Vetores de entrega de genes projetados: engenharia molecular e evolução de vetores virais adeno-associados para transferência aprimorada de genes. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 março; 25(3):489-99. Os vetores virais AAV recombinantes pseudotipados com capsídeos virais dos sorotipos 1, 2 e 5 exibem eficiência diferencial e tropismo celular após a entrega em diferentes regiões do sistema nervoso central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. Agosto de 2004; 10(2):302-17. Os vetores de vírus adeno-associados recombinantes auto-complementares (scAAV) promovem a transdução eficiente independentemente da síntese de DNA. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto de 2001; 8(16):1248-54.
Bomba de Ar	(Univentor)	Eheim 100
Conjuntos de sintonia de aspirador	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Máscara de Respiração Mouse Alumínio Anodizado Instrumentos	Biomédicos (Univentor)	-
Buprenorfina	Temgesic	ampolas	analgésico
Capilares	Ciência-Produtos	GB100TF-10	com pinças fillament
Dumont (#3, 12 cm, reta, 0,2 x 0,12 mm)	FST	11203-23
Barbeador elétrico	Phillips	-
Suturas de Ethicon (Ethilon, 6-0 e 3-0)	Ethicon-poliamide
Lubrificante para os olhos	Bepanthene	-
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7252	para visualização de líquidos injetados Interruptor de
roteamento de gás 4/2 conectores	Instrumentos biomédicos (Univentor)	8433020
pinça hemostática Halsted Mosquito (12,5 cm, reta)	FST	13011-12
Caixa de indução para camundongos com tampa móvel horizontalmente.Dimensões internas: CxLxA: 155x115x130 mm.Espessura da parede: 6 mm	Instrumentos biomédicos (Univentor)	-
Pinça de íris (10cm, curva, serrilhada)	FST	14007-14
Tesoura de íris (11cm, reta, carboneto de tungstênio)	FST	14501-14
Isofluran OP Tisch, aquecido eletricamente, smDimensões externas: 257x110x18 mm.Área de aquecimento: 190x90 mmA remoção do isoflurano escapando da máscara respiratória é para baixo em conformidade com os regulamentos	Instrumentos Biomédicos (Univentor)	-
Isoflurano (Attane)	JD anestesia inalatória médica
Microscópio óptico Basic DM E	Leica-4x		(N.A. 0,1 ∞/-), 10x (N.A. 0,22 ∞/0,17), 40x (N.A. 0,65 ∞/0,17), 100x (N.A. 1,25 ∞/0,17) objetivos
Micropipeta pulle	Ciência-Produtos	P-97
Pinça hemostática Mosquito (12,5cm, curva)	FST	13010-12
Thermopulller P-97	Sutter Instruments
Tygon 6/4 Material de tubulação para conexão de todas as peçasDiâmetro externo: 6mmDiâmetro interno: 4mmEspessura da parede: 1mm	Tesoura Vannas de instrumentos biomédicos (Univentor)
(8 cm, reta)	FST	15009-08

Instrumentos Biomédicos de