Injeção estereotáxica de hidrogel em um modelo de camundongo pós-AVC

Resumo

Fonte: Wilson, K.L., et al. Injeção de andaimes de biomaterial de hidrogel no cérebro após acidente vascular cerebral. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um hidrogel no núcleo do AVC de um camundongo pós-AVC, destacando seu papel na formação de andaimes que imitam a matriz extracelular, promovem a infiltração celular e apoiam a angiogênese, ressaltando seu potencial neuroterapêutico na recuperação do AVC.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

Injeção de hidrogel ou outros biomateriais

1. Realize a injeção de biomateriais em um horário definido pelo usuário. Neste experimento, as injeções foram realizadas entre 5 e 7 dias após o AVC. 2 - 6 μL de hidrogel são injetados.
   1. Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do mouse durante a anestesia (37 °C).
   2. Prepare tesouras autoclavadas, pinças, algodão, pomada para os olhos veterinários, cola cirúrgica ou material de sutura, álcool estéril e lenços de beta-iodo. Prepare a broca óssea com cabeças de broca estéreis e as seringas Hamilton de vidro de 25 μL com agulhas metálicas de 30 G.
   3. Ligue a esterilização do grânulo a 160 °C para permitir a esterilização dos instrumentos entre os ratos.
   4. Encaixar as bombas de injecção no dispositivo estereotáxico. Defina a taxa de fluxo para 1 μL/min e defina o volume para 4 μL.
   5. Prepare uma gaiola limpa para os ratos após a cirurgia.
2. Coloque o camundongo na câmara de indução com uma concentração de isoflurano de 4% para anestesiá-lo até que o movimento espontâneo pare e sua respiração atinja uma taxa lenta e constante.
   1. Depois de adormecido, transfira e prenda o mouse ao dispositivo estereotáxico com uma concentração de isoflurano de manutenção de 1,5%.
   2. Aplique a pomada veterinária em ambos os olhos.
   3. Raspe qualquer pelo que possa ter crescido novamente da cabeça do rato e prepare assepticamente a área usando um lenço umedecido com álcool seguido de um lenço de beta-iodo. Repita três vezes.
      NOTA: Se necessário, use um lenço umedecido com álcool extra no final para limpar todo o beta iodo, pois causa irritação na pele e leva os camundongos a coçar o crânio após a cirurgia.
3. Usando a pequena tesoura e / ou fórceps, reabra a pele acima do cérebro. Use algodão com solução salina estéril ou PBS (solução salina tamponada com fosfato) para limpar quaisquer detritos do crânio. Um círculo branco-amarelo (o traço, Figura 1B) e o orifício da broca serão visíveis. Se o tecido morto não for visível, provavelmente não ocorreu nenhum derrame. Se o orifício da rebarba não estiver centralizado acima do curso, perfure novamente para centralizá-lo.
4. Oriente a bomba de injeção sobre o mouse e trave-a a 90°. Limpe a seringa com solução salina estéril ou PBS antes de recarregar o material.
   1. Depois de limpa, desmonte a seringa de vidro para que não haja agulha. Coloque a seringa usando uma pipeta de deslocamento positivo de 25 μL com 10 μL de hidrogel (ou outro biomaterial aqui com ou sem células).
   2. Usando o êmbolo da seringa, empurre o gel totalmente para a frente da seringa. Em seguida, remonte a seringa e continue empurrando até que o gel exale visivelmente da agulha.
5. Coloque a seringa na bomba. A parte traseira da bomba pode precisar ser ajustada para que a seringa se encaixe. Ajuste a taxa de fluxo para 30 μL/min, selecione Retirar ou Injetar dependendo da direção que precisa se mover e pressione Iniciar. Pressione Parar quando a parte traseira da bomba estiver no local correto.
   1. Aparafuse a parte de trás da bomba para que a seringa fique segura. Se ajustes foram feitos anteriormente, certifique-se de que a taxa de fluxo esteja ajustada para 1 μL / min e esteja configurada para injetar.
6. Mova a bomba nas direções x e y para orientá-la sobre o orifício. Mova a bomba para baixo na direção z até que a agulha da seringa toque na parte superior do orifício.
7. Redefina o Z no console do display digital. Em seguida, mova a seringa para baixo na direção z 0.750 mm. Se a seringa dobrar ou houver resistência, o crânio cicatrizou ou não foi completamente perfurado e precisa ser perfurado novamente.
8. Pressione Start no console da bomba para injetar 4 - 6 μL do hidrogel a uma taxa de 1 μL/min.
9. Defina um temporizador de 5 minutos quando a bomba parar de injetar para permitir que o gel comece a reticular.
10. Após 5 minutos, puxe lentamente a seringa girando o z-nob. Observe se algum material é puxado acidentalmente ou vaza do orifício. Desbloqueie a bomba e afaste-a do mouse quando a agulha estiver longe o suficiente do crânio.
11. Usando fórceps, cola cirúrgica ou suturas, feche a pele acima da cabeça. Coloque o mouse na gaiola limpa e observe sua recuperação. Deve levar cerca de 5 a 10 minutos para o camundongo se recuperar da anestesia.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática de bregma e localização de traço. (A) Os lobos parietais se encontram no topo para formar o bregma. A colocação do laser foi centralizada 2,0 mm à esquerda do bregma. (B) ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
25uL Seringa Hamilton 702RN, sem agulha	de 14824663	Fishcer Scientific	usadas para injetar biomateriais
25uL Pipeta de deslocamento positivo	Gilson	M-25
Plataforma de estágio ajustável	Kopf Instrumentos	901
C57BL/6 Ratos	Jackson Laboratory	664	8-12 semanas de idade Montagem da
gaiola Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" de comprimento, diâmetro 6mm, pacote com 4 - para anexar laser a esterotax
Cotonetes de algodão	VWR	89031-288
CP 25 pontas de pipeta	F148012
	Gilson Kopf Instrumentos	HP-4M
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra	Miltex V96-118
Mini-bomba de fluxo variável	Thomas Scientific	70730-064	Bomba para Suporte
de cabeça de anestesia de gás de camundongo	Kopf Instruments	923-B
Caixa de controle Nanojet	Chemyx	10050
Cabeçalho da bomba Nanojet	Chemxy	10051	Anexe ao dispositivo estereotáxico para injeção de biomaterial
Agulha RN 30G PT STY 3, 0,5 polegadas	Fishcer Scientific	NC9459562
Barras de ouvido sem ruptura 60º	Kopf Instruments	922
Pomada Veterinária Puralube	Dr. Foster Smith	9N-76855
Sonda Retal Mouse	Kopf Instruments	Ret-3-ISO
Sol-M U-100 Seringa de insulina com marcações de 1/2 unidade 0,5 mL	VWR	10002-726	Para injetar rosa bengala
StainTray Slide Sistema de Coloração	Simport Scientific	M920-2	Para coloração de lâminas
Dispositivo estereotáxico	Kopf Instruments	940	Animal Instrumento Estereotáxico
Estudante Adson Fórceps -1x2 dentes	Fine Science Tools	91127-12
Pinça Fina para Estudantes - Hastes retas/largas	Ferramentas Fine Science	91113-10
Controlador de Temperatura	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Composto Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931

Seringas Placa de aquecimento Small