Construção de uma Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta em um Modelo de Lesão Nervosa em Rato

Abstract

Fonte: Svientek, S. R., et al. Fabricação da Interface Regenerativa Composta de Nervos Periféricos (C-RPNI) no rato adulto. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a construção cirúrgica de uma interface regenerativa composta de nervos periféricos (C-RPNI) em um modelo de lesão nervosa periférica em ratos. O procedimento envolve a fixação de um nervo fibular seccionado a um enxerto muscular e a sobreposição com um enxerto de pele dérmica para promover a regeneração do nervo. Com o tempo, os neurônios motores e sensoriais restabelecem conexões dentro dos enxertos, possibilitando a formação de estruturas neuromusculares e sensoriais funcionais.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

NOTA: Os ratos doadores têm livre acesso a comida e água antes dos procedimentos de doação de pele e músculos. A eutanásia é realizada sob anestesia profunda, seguida de injeção intracardíaca de cloreto de potássio com um método secundário de pneumotórax bilateral. Qualquer linhagem de rato pode teoricamente ser utilizada com este experimento; no entanto, nosso laboratório alcançou resultados consistentes em ratos Fischer F344 machos e fêmeas (~ 200-250 g) aos dois a quatro meses de idade. Os ratos doadores devem ser isogênicos aos ratos experimentais.

1. Preparo do enxerto dérmico

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1. Anestesiar o rato doador em câmara de indução, utilizando solução de isoflurano a 5% em oxigênio a 0,8-1 L/min. Uma vez que o rato tenha sido anestesiado, retire da câmara de indução e coloque em um cone nasal de reinalação, diminuindo o isoflurano para 2-2,5% para manutenção da anestesia.
2. Administre uma solução de 0,02-0,03 mL de carprofeno (50 mg / mL) em 0,2 mL de solução salina estéril por via subcutânea entre as omoplatas para analgesia.
3. Aplique pomada de lágrimas artificiais em ambos os olhos para prevenir úlceras de córnea.
4. Usando uma tesoura, raspe todo o (s) membro (s) posterior (is) inferior (is), a região do tornozelo e as laterais da (s) pata (s).
5. Limpe o membro posterior escolhido e a superfície plantar da pata com álcool, seguido de solução de iodopovidona, terminando com uma limpeza final com álcool para remover a iodopovidona residual.
6. Usando uma broca de alta velocidade com micromotor portátil com uma pedra de polimento redonda removível de grão fino (4000 rpm), rebarba a superfície plantar da pata para remover a epiderme. Durante a rebarba, aplique gotas de soro fisiológico para não queimar a pele. A derme subjacente terá uma aparência brilhante com sangramento pontual.
7. Aplique um torniquete na extremidade inferior para diminuir o fluxo sanguíneo.
8. Remova a pele plantar bruscamente com um bisturi # 15 e coloque-a em gaze umedecida com solução salina para evitar a dessecação. Alguns tecidos tendíneos e conjuntivos serão inerentemente removidos com a pele nesta etapa e serão removidos posteriormente.
9. Aplique uma gaze no pé sangrando para retardar a hemorragia. Repita as etapas 1.5 a 1.9 se estiver fazendo duas construções.
10. Sob um microscópio (aumento de 20x), remova o tecido tendíneo e conjuntivo da camada profunda do enxerto de pele usando uma microtesoura. Tome cuidado para não fazer furos no enxerto. O enxerto dérmico diluído deve ser ligeiramente opaco contendo apenas derme, medindo aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm de tamanho.
11. Coloque em gaze umedecida com solução salina até que esteja pronto para a fabricação da construção C-RPNI. Os enxertos devem ser utilizados dentro de 2 horas após a colheita.

2. Preparação do enxerto muscular

1. Faça uma incisão longitudinal ao longo da face anterior do membro posterior inferior, logo acima do tornozelo até logo abaixo do joelho, com um bisturi # 15. Dissecar através do tecido subcutâneo para expor a musculatura subjacente.
2. Na face distal da incisão, expor as inserções tendíneas da musculatura do membro inferior. O tibial anterior (TA) é tipicamente o maior e mais anterior dos músculos, e logo abaixo e posteriormente a esse músculo encontra-se o extensor longo dos dedos (EDL). Isole o tendão distal do EDL dos outros tendões da área, tomando cuidado para não incisar sua inserção neste ponto.
3. Garanta o isolamento do tendão correto inserindo os dois dentes de uma pinça embaixo do tendão e exercendo pressão para cima abrindo a pinça para causar a excursão do tendão. A manipulação desse tendão deve fazer com que todos os dedos dos pés se estendam simultaneamente.
4. Realize uma tenotomia distal com uma tesoura de íris afiada e separe o músculo dos tecidos circundantes sem rodeios com tenotomias (ou outra tesoura de ponta romba), trabalhando proximalmente para encontrar a origem tendínea.
5. Uma vez que o tendão proximal é visualizado, novamente execute uma tenotomia utilizando uma tesoura de íris afiada. Coloque o enxerto muscular em uma gaze umedecida com solução salina para evitar a dessecação.
6. Uma vez que todos os enxertos desejados tenham sido removidos de um rato doador, eutanasiar principalmente por injeção intracardíaca de KCl (1-2 mEq K + / kg) seguida de eutanásia secundária com pneumotórax por punção bilateral com lâmina # 15.

3. Isolamento e preparação do nervo fibular comum

1. Anestesiar e fornecer analgesia ao rato experimental de acordo com o protocolo descrito nas etapas 1.1-1.3.
2. Depile a coxa desejada e limpe com álcool, betadine e termine com álcool para remover vestígios de betadine.
3. Mova o animal da mesa de preparação cirúrgica para a mesa do microscópio cirúrgico e coloque-o em uma almofada de aquecimento com uma sonda de temperatura para manutenção da temperatura corporal. Mantenha o isoflurano a 2-2,5% e o oxigênio a 0,8-1 L/min.
4. Marque a incisão, estendendo-se apenas distal à incisura isquiática até a porção inferior do joelho. Essa marcação deve ser inferior e inclinada para longe do fêmur. Faça a incisão com uma lâmina # 15, incisando através da fáscia subjacente do bíceps femoral.
5. Disseque cuidadosamente através do músculo bíceps femoral com um hemostático ou uma microtesoura de ponta romba até o espaço subjacente ao bíceps femoral.
   NOTA: O nervo ciático viaja aproximadamente na mesma direção da incisão inicial que foi feita. Existem três ramos, normalmente com o nervo sural posterior e o fibular comum e o nervo tibial viajando superficial e profundamente até o joelho, respectivamente.
6. Após a identificação do nervo fibular comum (CP), usando uma micropinça de ponta fina e microtesoura, isole cuidadosamente o nervo CP dos outros ramos ciáticos e remova qualquer tecido conjuntivo remanescente distalmente.
7. No ponto em que o nervo cruza a superfície do joelho, corte bruscamente o nervo com uma microtesoura.
   NOTA: O uso de tesouras afiadas é extremamente importante nesta etapa, pois causar trauma significativo no nervo pode aumentar o risco de formação de neuroma.
8. Libere cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo remanescente do nervo CP e trabalhe proximalmente para liberar o nervo em um comprimento de aproximadamente 2 cm.

4. Fabricação de construção C-RPNI

1. Remova o enxerto muscular da gaze umedecida com solução salina e remova todo o tecido tendíneo central, bem como um pequeno segmento central do epimísio. Deixe as extremidades tendíneas intactas.
2. Usando um 8-0 sutura de náilon, prenda o epineuro da extremidade seccionada do nervo CP à área do enxerto muscular desprovida de epimísio com dois pontos interrompidos de cada lado do nervo.
3. Prenda o enxerto muscular ao periósteo do fêmur com um único ponto interrompido de náilon 6-0 proximal e distalmente, com a junção nervo-músculo voltada para longe do fêmur.
   NOTA: Prenda o músculo de forma que fique no comprimento normal e relaxado. Tente não alongar o músculo significativamente ou deixar muita frouxidão ao segurar.
4. Coloque um 8-0 ponto de náilon na margem inferior e central do epimísio do enxerto muscular, prendendo-o ao epineuro do nervo CP de forma a criar frouxidão no nervo dentro do enxerto muscular e ajudar a aliviar qualquer tensão futura a que possa ser exposto com deambulação posterior.
5. Remova o enxerto de pele da gaze umedecida com solução salina e disponha-o no enxerto muscular de forma a cobrir completamente o nervo e a maior parte do músculo. Certifique-se de que a margem profunda da derme esteja apoiada no músculo. Apare qualquer derme que se estenda além da borda do músculo.
6. Prenda o enxerto de pele ao enxerto muscular circunferencialmente usando 8-0 suturas interrompidas de nylon. Normalmente, 4-8 suturas totais são usadas, dependendo do tamanho da construção.
7. Feche a fáscia do bíceps femoral sobre a construção de forma contínua com sutura crômica 5-0.
8. Feche a pele sobrejacente com uma sutura crômica 4-0 em forma de corrida.
9. Limpe a área cirúrgica com uma compressa com álcool e aplique pomada antibiótica.
10. Interrompa o anestésico inalatório e permita que o rato se recupere com fontes de comida e água separadas dos companheiros de gaiola.

Materials