Isolamento fotodegradável à base de hidrogel de colônias bacterianas em matrizes de micropoços

Resumo

Fonte: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar colônias bacterianas dentro de matrizes de micropoços de silício. As células bacterianas são primeiro carregadas em micropoços, encapsuladas em um hidrogel reticulado e cultivadas em colônias distintas. Após a exposição à luz ultravioleta, a degradação direcionada do hidrogel permite a extração seletiva de colônias individuais.

Protocolo

1. Cepas bacterianas e protocolos

1. de cultura Listrar colônias de bactérias em placas de ágar suplementadas com meios de crescimento apropriados. Neste relatório, Bacillus subtilis (cepa 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) é cultivado em ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM de glicose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L de ágar) em placas de ágar suplementadas com 100 μg/mL de espectinomicina e Escherichia coli (cepa 25922, ATCC) em placas de ágar ATGN suplementadas com 100 μg/mL de ampicilina.
   NOTA: Relatórios anteriores de encapsulamento e liberação de hidrogel com esses materiais usaram células A. tumefaciens C58
2. Escolha as colônias desejadas das placas de ágar ATGN e inicie as culturas durante a noite. Para as estirpes de E. coli e B. subtilis aqui utilizadas, cultivar a 37 °C agitando a 215 rpm em meio líquido ATGN durante 24 h. Armazene as culturas de células em glicerol a 50% a -80 °C até uso futuro.
3. Colher colónias de ambas as estirpes das reservas de glicerol utilizando alças de inoculação estéreis e incubar em meio líquido ATGN durante 24 h a 37 °C e 215 rpm.

2. Preparação do material necessário para a formação do hidrogel

1. Síntese fotodegradável de poli(etilenoglicol)-o-nitrobenzil diacrilato (PEG-o-NB-diacrilato)
   NOTA: A síntese interna do diacrilato de PEG-o-NB foi bem descrita e relatada anteriormente. Alternativamente, como a síntese é rotineira, ela pode ser terceirizada de uma instalação de síntese química.
2. Reticulação buffer
   1. Pegue a receita do meio selecionado para a cepa bacteriana e prepare o meio com 2x nutrientes. Adicione fosfato, por exemplo, NaH₂PO_4, ao meio até uma concentração final de 100 mM. Em seguida, ajuste o valor do pH para 8 usando 5 M NaOH (aq).
   2. Esterilize a solução tampão e armazene-a a -20 °C até uso posterior.
      NOTA: Deixe de fora quaisquer metais de transição presentes no meio, pois esses metais catalisam a oxidação dos tióis em dissulfetos.
3. Solução de diacrilato de PEG-o-NB
   1. Para cada mg da alíquota de pó de diacrilato de PEG-o-NB (peso molecular de 3.400 Da), adicione 3,08 μL de água ultrapura para atingir uma concentração de 49 mM de diacrilato de PEG-o-NB (concentração de acrilato de 98 mM).
   2. Vortex a solução até que esteja bem misturada e armazene esta solução a -20 °C até nova utilização.
4. Solução de PEG-tiol de 4 braços
   1. Para preparação de PEG-tiol de 4 braços (peso molecular de 10.000 Da), adicione 4 μL de água ultrapura por mg de pó para atingir uma concentração de 20 mM (80 mM de concentração de tiol).
   2. Vortex esta solução até que esteja bem misturada e armazene-a a -20 °C até nova utilização.

5. Fabricação de matrizes de micropoços de silício Revestimento

de

1. parileno: Use o protocolo padrão descrito em artigos de pesquisa anteriores para revestir wafers de silício com parileno.
2. Microfabricação: Siga o protocolo descrito na literatura para projetar e fabricar o arranjo de micropoços (Figura 1).
   NOTA: Técnicas fotolitográficas padrão foram aplicadas para fabricar arranjos de micropoços em wafers de silício revestidos com parileno.

7. Formação de hidrogel em matrizes de micropoços

1. Semeadura de bactérias em matrizes de micropoços
   NOTA: 700 μL de suspensões celulares de 0,1 OD₆₀₀ (densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm) foram semeadas sobre os substratos da matriz de micropoços, e o método de decolagem de parileno foi aplicado para remover as células do fundo.
2. Prepare a solução precursora de hidrogel adicionando 5,6 μL do diacrilato de PEG-o-NB com 12,5 μL de solução salina tamponada com fosfato pH 8 ATGN e misturando com 6,9 μL da solução de tiol PEG de quatro braços.
3. Pipete 12,5 μL da solução precursora em uma lâmina de vidro perfluoroalquilada não reativa e coloque dois espaçadores de aço de 38 μm (consulte a Tabela de Materiais) em dois lados opostos do substrato da matriz de micropoços inoculado com células.
4. Inverta a lâmina de vidro perfluoroalquilada com a gota da solução precursora e coloque a gota no meio do substrato do micropoço. Em seguida, incube por 25 min em temperatura ambiente (RT) para formação de hidrogel.
5. Remova cuidadosamente a lâmina de vidro do substrato do micropoço. A membrana de hidrogel deve permanecer presa ao substrato do micropoço.

Resultados

Figura 1: Projeto e fabricação de matrizes de micropoços. (A) Técnicas padrão de microfabricação foram aplicadas para fabricar matrizes de micropoços em bolachas de silício. (B) Cada substrato consistia em 7...

Materiais