Separação de Frações de Membrana Interna e Externa de Bactérias Gram-Negativas

Resumo

Fonte: Cian, M. B. et. al., Separação do Envelope Celular para Bactérias Gram-negativas em Frações de Membrana Interna e Externa com Ajustes Técnicos para Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a separação das frações de membrana interna e externa de bactérias Gram-negativas usando ultracentrifugação com gradiente de sacarose. As frações de membrana são purificadas e armazenadas em baixas temperaturas para análise direcionada de componentes específicos da membrana.

Protocolo

1. Reagentes gerais e preparação de meios para extração por membrana

1. Meios de crescimento bacteriano: Prepare e esterilize 1 L de meio de caldo em um frasco de 2 L completamente limpo e autoclavado.
2. Tampão de ressuspensão geral (tampão tris(hidroximetil)aminometano 1 M (tampão Tris) pH 7,5; 50 mL): Dissolva 6,05 g de base Tris em 30 mL de H₂O. Ajuste o pH para 7,5 com 5 M HCl. Ajuste o volume final para 50 mL com H₂O ultrapuro.
3. Estoque mestre de solução de quelação catiônica divalente (ácido etilenodiamina tetracético 0,5 M, EDTA pH 8; 100 mL): Adicione 18,6 g de tetraacetato de etileno dissódico · 2H₂O a 80 mL de H₂O. Agite vigorosamente e ajuste o pH para 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH). Ajuste o volume final para 100 mL com H₂O.
   ultrapuro NOTA: O sal dissódico do EDTA não se dissolverá até que o pH da solução seja ajustado para ~ 8,0 pela adição de NaOH.
4. Tampão osmótico A (sacarose 0,5 M, Tris 10 mM pH 7,5; 1 L): Pesar 171,15 g de sacarose e transferi-lo para um cilindro de 1 L. Adicione 10 mL de 1 M Tris pH 7,5. Ajustar para um volume final de 1 L com H₂O. Conservar a 4 °C.
5. Lisozima (10 mg / mL; 5 mL): Pesar 50 mg de lisozima (clara de ovo de galinha) e dissolver em 5 mL de H₂O. Ultrapuro Armazene a 4 ° C.
6. Solução de quelação catiônica divalente diluída (1,5 mM EDTA; 500 mL): Adicione 1,5 mL de EDTA 0,5 M (Etapa 1.3) a 497,5 mL de H₂O ultrapuro. Armazene a 4 ° C.
7. Tampão osmótico B (0,2 M de sacarose, 10 mM Tris pH 7,5; 2 L): Pesar 136,8 g de sacarose e transferi-lo para um cilindro de 2 L. Adicione 20 mL de 1 M Tris pH 7,5. Ajuste o volume final para 2 L com H₂O. Armazene a 4 °C.
8. Cofator de nuclease (cloreto de magnésio 1 M, MgCl₂; 10 mL): Dissolva 2,03 g de MgCl₂ · 6H₂O em 8 mL de H₂O ultrapuro. Ajuste o volume para 10 mL. Armazene em temperatura ambiente.
9. Coquetel de solução de nuclease incluindo enzimas RNase e DNase: Ver Tabela de Materiais. Conservar a -20 °C.
10. Coquetel de inibidores de protease: consulte a Tabela de Materiais. Conservar a 4 °C.
11. Solução de gradiente de sacarose isópica de baixa densidade (20% p/v de sacarose, 1 mM de EDTA, 1 mM de solução de Tris pH 7,5; 100 mL): Pesar 20 g de sacarose e transferir para um cilindro de 200 mL. Adicione 100 μL de tampão Tris 1 M pH 7,5 e 200 μL de EDTA 0,5 M pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com H₂O ultrapuro. Armazene em temperatura ambiente.
12. Solução de gradiente de sacarose isópnica de média densidade (53% p/v de sacarose, 1 mM de EDTA, 1 mM de solução de Tris pH 7,5; 100 mL): Pesar 53 g de sacarose e transferir para um cilindro graduado de 200 mL. Adicione 100 μL de tampão Tris 1 M pH 7,5 e 200 μL de EDTA 0,5 M pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com H₂O ultrapuro. Armazene em temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solução em um cilindro graduado para garantir a precisão devido à alta porcentagem de sacarose. Adicione uma barra de agitação magnética e mexa até que a sacarose esteja completamente dissolvida na solução. Esse processo pode levar várias horas.
13. Solução de gradiente de sacarose isópica de alta densidade (73% p/v de sacarose, 1 mM de EDTA, 1 mM de solução de Tris pH 7,5; 100 mL): Pesar 73 g de sacarose e transferir para um cilindro graduado de 200 mL. Adicione 100 μL de tampão Tris 1 M pH 7,5 e 200 μL de EDTA 0,5 M pH 8. Ajuste o volume final para 100 mL com H₂O ultrapuro. Armazene em temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solução em um cilindro graduado para garantir a precisão devido à alta porcentagem de sacarose. Adicione uma barra de agitação magnética e mexa até que a sacarose esteja completamente dissolvida. Esse processo pode levar várias horas.
14. Tampão de armazenamento por membrana isolada (tampão Tris 10 mM pH 7,5; 1 l): Adicione 1 mL de tampão Tris 1 M pH 7,5 a um balão de 1 L e ajuste o volume final para 1 L com H₂O ultrapuro.

2. Preparação de bactérias para extração por membrana

1. Listre as bactérias dos estoques de glicerol congelados em placas de ágar fresco. Conservar as placas a 4 °C assim que as colónias se desenvolverem. Inocule uma única colônia em um tubo de 5 mL cheio de meio de caldo e cultive as bactérias conforme desejado durante a noite.
2. Dilua a cultura bacteriana durante a noite em 1 L de meio de caldo preferido e cultive a bactéria até que a densidade óptica desejada seja alcançada.
   NOTA: A inoculação de uma única colônia bacteriana em 1 L de meio de caldo é recomendada para genótipos mutantes que são propensos a suprimir fenótipos de crescimento, mas algumas bactérias Gram-negativas simplesmente crescem mais lentamente do que outras. Se não for possível atingir uma densidade de cultura suficiente por inoculação de colônia única, diluir uma cultura durante a noite em 1 L de meio é uma estratégia para sincronizar o crescimento. A composição da membrana bacteriana varia dependendo da fase de crescimento da cultura (fase logarítmica versus estacionária). Curvas de crescimento que medem a mudança na densidade óptica das culturas bacterianas em função do tempo devem ser realizadas com todas as cepas para correlacionar a densidade da cultura com a fase de crescimento.
3. Coloque os frascos contendo as culturas de caldo no gelo. Ler a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) e calcular o volume de cultura que equivale a entre 6,0 e 8,0 x 10¹¹ unidades formadoras de colónias bacterianas (UFC). Para S. Typhimurium, isso corresponde a 1 L de cultura a uma DO₆₀₀ entre 0,6 - 0,8, uma vez que uma DO 600 de 1,0 é igual a aproximadamente 1,0x10⁹ UFC / mL. Adicione este volume a um tubo de centrífuga e certifique-se de que as culturas restantes permaneçam no gelo até que sejam usadas.
4. Pulverize as bactérias por centrifugação a 4 °C a 7.000-10.000 x g em uma centrífuga de alta velocidade de ângulo fixo por 10 min.
   NOTA: Pré-resfrie e mantenha as centrífugas em baixa temperatura. Mantenha as amostras no gelo durante todo o procedimento.
5. Transvase e descarte o sobrenadante com cuidado.
   NOTA: Se as frações da membrana não forem extraídas imediatamente, o pellet pode ser congelado rapidamente e/ou armazenado a -80 °C. No entanto, recomenda-se proceder diretamente com a plasmólise no mesmo dia em que as células são colhidas, especialmente para espécies não enterobacterianas.

3. Dissociação da membrana externa e plasmólise

1. Descongele os grânulos celulares no gelo se eles foram previamente armazenados a -80 ° C e retenha as amostras no gelo pelo restante do procedimento. Ressuspenda cada pellet de célula dentro do tubo de centrífuga em 12,5 mL de tampão A. Adicione uma barra de agitação magnética à suspensão das células.
2. Adicione 180 μL de lisozima 10 mg / mL (concentração final de 144 μg / mL) a cada ressuspensão celular. Mantenha as amostras no gelo, mexendo por 2 min.
3. Adicione 12,5 mL de solução de EDTA 1,5 mM a cada ressuspensão celular e continue mexendo no gelo por mais 7 min.
4. Transvase a suspensão para um tubo cónico de 50 ml e centrifugue a 9.000-11.000 x g durante 10 min a 4 °C.
5. Descarte os sobrenadantes em um recipiente de resíduos de risco biológico e retenha os pellets no gelo.
6. Adicione 25 mL de tampão B ao pellet celular.
7. Adicione 55 μL de 1 M MgCl₂, 1 μL de reagente de nuclease RNase/DNase (para evitar problemas de viscosidade associados a bactérias submetidas à plasmólise antes da homogeneização) e 1 μL de coquetel de inibidor de protease ao volume de tampão B que fica no topo do pellet celular
8. Ressuspenda o pellet na mistura de tampão B. Pipete vigorosamente e vortex até observar uma solução homogênea.
   NOTA: É muito importante ter uma solução homogênea antes de prosseguir para a Etapa 4 deste protocolo. As células ressuspensas devem ter uma aparência e consistência viscosas semelhantes a massa de bolo.
9. Vortex cada sample por 15 s. Mantenha as suspensões no gelo e prossiga para a Etapa 4.

4. Homogeneização e Lise Pressurizadas
NOTA: Vários métodos podem ser usados para lise. A sonicação não é ideal devido à geração de calor. A lise osmótica pode ser alcançada, mas muitas vezes é ineficiente. Portanto, recomendamos lise de alta pressão. A lise de alta pressão pode ser alcançada usando uma variedade de instrumentos. Sugerimos máquinas de homogeneização, como a prensa francesa ou a Emusliflex. Trabalhamos com muitos tipos de bactérias Gram-negativas cuja resposta a soluções de sacarose osmolar alta varia. A etapa de homogeneização de alta pressão melhora a eficiência, a reprodutibilidade e o rendimento.

1. Pré-resfrie a pilha de prensa francesa a 4 °C ou insira a bobina de metal da máquina homogeneizadora no gelo.
2. Despeje a amostra na célula de pressão francesa ou no cilindro de amostra homogeneizador e coloque a célula sob a pressão de homogeneização desejada (10.000 psi deve ser adequado ao usar uma prensa francesa ou 20.000 psi ao usar um homogeneizador).
3. Ajuste a vazão de saída para aproximadamente uma gota por segundo, mantendo a pressão se estiver utilizando uma prensa francesa.
4. Colete o lisado celular em tubos cônicos de 50 mL, mantendo as amostras no gelo.
5. Repita as etapas 4.2-4.4 três a cinco vezes para obter uma lise completa, o que normalmente é indicado por um aumento gradual na transparência da amostra.
   NOTA: A câmara de amostra deve ser lavada e equilibrada com o tampão B entre as amostras.
6. Mantenha as células lisadas no gelo.

5. Fracionamento total da membrana Centrifugue

1. as amostras bacterianas lisadas a 6.169 x g por 10 min a 4 ° C para granular o material celular intacto restante. (por exemplo, células bacterianas não lisadas).
2. Distribua a porção restante do sobrenadante, que agora contém as membranas homogeneizadas, em um frasco de policarbonato para ultracentrifugação.
   CUIDADO: Se necessário, as amostras de células podem ser balanceadas diluindo com tampão B.
3. Ultracentrifugar os lisados celulares a 184.500 x g durante pelo menos 1 h, a 4 °C. Esta etapa pode ser realizada durante a noite sem afetar a qualidade das membranas.
4. Rejeitar o sobrenadante restante presente no tubo de ultracentrífuga e manter os sedimentos de membrana no gelo (figura 1).
5. Ressuspenda os grânulos de membrana em 1 mL da solução de gradiente de isopicnica-sacarose de baixa densidade usando um homogeneizador glass-Dounce. Transfira o homogeneizado da amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta de vidro Pasteur e retenha em gelo.
   NOTA: Se apenas a análise da composição total da membrana for desejada, substitua 1 mL de solução de gradiente de isopicnica-sacarose de baixa densidade por 1 mL de tampão de armazenamento de membrana isolado. A etapa 5.5 é o ponto final do isolamento se apenas amostras totais de membrana bacteriana forem desejadas. Armazene as amostras a -20 °C até que seja necessária uma análise adicional a jusante.

6. Ultracentrifugação com gradiente de densidade para separar as membranas duplas

1. Reúna o número apropriado de tubos de polipropileno de 13 mL ou tubos abertos ultratransparentes especificados para um rotor de caçamba oscilante e ultracentrífuga.
2. Segure o tubo em uma posição ligeiramente inclinada e prepare o gradiente de sacarose adicionando lentamente soluções de sacarose de densidade mais alta para densidade mais baixa na seguinte ordem: 2 mL de 73% p / v de sacarose, 1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,54 mL de 53% p / v de sacarose, 1 mM de EDTA, 1 mM de Tris pH 7,5 < ol style='list-style-type:decimal;'>
3. Em seguida, adicionar a fração total da membrana (1 ml), que foi ressuspensa na solução de sacarose a 20% p/v (passo 5.5). Evite misturar a fração de membrana com a solução de sacarose que está abaixo dela. As divisões devem ser visíveis entre cada uma dessas camadas.
4. Por fim, encher o tubo com a solução de gradiente de isopicnica-sacarose de baixa densidade (aprox. 6 ml). Tubos de polipropileno e tubos abertos ultratransparentes devem ser preenchidos o máximo possível (2 ou 3 mm do topo do tubo) para suporte do tubo.

Ajuste para Acinetobacter baumannii 17978

1. Adapte um gradiente de sacarose ajustado para uso com diferentes espécimes bacterianos. Para A. baumannii, o seguinte gradiente de sacarose proporcionou uma separação mais completa das membranas (Figura 2).2 mL de sacarose a 73% p/v, EDTA 1 mM, Tris pH 7,54 mL de sacarose a 45% p/v, EDTA 1 mM, Tris pH 7,5 mM
2. Em seguida, adicione a fração total da membrana (1 mL), que foi ressuspensa na solução de sacarose a 20% p/v (etapa 5.5). Evite misturar a fração de membrana com a solução de sacarose que está abaixo dela. As divisões devem ser visíveis entre cada uma dessas camadas.
3. Finalmente, encha o tubo com solução de gradiente de sacarose isopícnica de baixa densidade (aprox. 6 mL). Tubos de polipropileno e tubos abertos ultratransparentes devem ser preenchidos o máximo possível (2 ou 3 mm do topo do tubo) para suporte do tubo.

Ultracentrifugar as amostras usando um rotor de caçamba oscilante a 288.000 x g e 4 °C durante a noite.
NOTA: Para os volumes utilizados nas etapas anteriores, recomendamos tempos de centrifugação entre 16 h e 23 h.

Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P1000 a cerca de 5 mm da ponta. Usando a pipeta, remova a camada superior da membrana interna marrom (IM). Transferir a fracção IM para um frasco de policarbonato para ultracentrifugação.

Deixe cerca de 2 mL da solução de sacarose acima da interface de 53-73% para garantir que a membrana externa branca inferior (MO) não seja contaminada com a fração IM. Repita o procedimento de pipetagem da etapa 6.4 para a fração OM (Figura 1).
NOTA: As membranas também podem ser coletadas perfurando os tubos da centrífuga na parte inferior com uma agulha e coletando-os como frações gota a gota.

Preencher o vazio restante do tubo de ultracentrífuga com tampão de armazenamento de membrana isolada e misturar por inversão ou pipetagem. Manter as amostras no gelo.

Coletar as membranas agora lavadas e isoladas por ultracentrifugação a 184.500 x g por 1 h a 4 °C.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as membranas por homogeneização Dounce. Adicione 500-1000 μL de buffer de armazenamento. Colete amostras em tubos de microcentrífuga de 2 mL.

Armazenar as amostras de membrana bacteriana a -20 °C.

Resultados

Figura 1: Um esquema que descreve o procedimento de isolamento da membrana bacteriana Gram-negativa descrito neste artigo de métodos. O procedimento usado para coletar células bacterianas e isolar as membranas total, interna (IM) e externa (MO) é mostrado...

Materiais