Avaliação das interações bactéria-célula hospedeira usando esferas biomiméticas

Resumo

Fonte: Stones, D. H., et al. Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactéria-hospedeiro. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o uso de esferas bacteriomimiméticas para quantificar a adesão bacteriana às células epiteliais hospedeiras em condições competitivas. Ele descreve as etapas envolvidas no tratamento das células, lisando-as e plaqueando diluições em série para medir unidades formadoras de colônias.

Protocolo

1. Medição da adesão bacteriana
   1. Nos pontos de tempo indicados (por exemplo, 1 hora após a infecção), remova o meio da camada celular.
   2. Lave bem a camada celular com solução salina (PBS) estéril e pré-aquecida tamponada com fosfato (pelo menos 3-4 lavagens de 1 ml de PBS cada) para remover quaisquer células soltas.
   3. Lise as células hospedeiras adicionando 1 ml de uma solução estéril de Triton X-100 a 1 % v/v em PBS por alvéolo. Incubar a placa a 37 °C durante 5 min.
   4. Pipetar cada amostra várias vezes antes de transferir o conteúdo de cada alvéolo para tubos separados de 1,5 ml. Prepare diluições seriadas de 10 vezes de amostras em PBS estéril (por exemplo, use 100 ml de amostra e 900 ml de PBS).
   5. Colocar 100 μl de cada amostra em ágar marinho Luria-Bertani (MLB) e espalhar usando um espalhador de células. Otimize quais diluições serão plaqueadas dependendo das cepas bacterianas e do ponto de tempo.
      Nota: Para a configuração experimental descrita, diluições de 10,⁵ ou 10⁶ vezes fornecem um número adequado de unidades formadoras de colônias (UFCs).
   6. Incubar as placas a 37 °C O/N e enumerar as bactérias por contagem de colónias.

Materiais

< >< table class='ck-table-resized'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários Reagentes Grânulos de poliestireno modificados com carboxilatoSigmaCLB9prejudicial; uma variedade de tamanhos e cores de partículas alternativos está disponívelDulbecco's Modified Eagle's Medium - glicose alta - Com 4500 mg/L de glicose e bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, piruvato de sódio e vermelho de fenol, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de célulasSigmaD1145para experimentos de infecçãoDMEMSigmaD6429para manutenção de células hospedeiras cultivadasSoro fetal bovino, inativado pelo calorSigmaF9665suplemento para meio de cultura de tecidosPenicilina-estreptomicina - Solução estabilizada, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL, filtrada estéril, BioReagent, adequada para cultura de célulasSuplemento SigmaF9665para meio de cultura de tecidosPBSSigmaD8537 Placas de plástico de 24 poçosGreiner662160 Equipamento Instalações de cultura de tecidos Pipeta multicanal