1. Colheita de amostras para extração de polifosfato
- Cultive bactérias nas condições de interesse para determinar o teor de poliP. Para este protocolo, cultive Lactobacillus reuteri durante a noite a 37 ° C sem agitação em meio de indução enzimática málica (MEI) sem cisteína (MEI-C).
- Colha células suficientes por centrifugação em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para totalizar 50 a 100 μg de proteína celular (consulte a etapa 3 abaixo). Para E. coli, isso é 1 mL de uma cultura em fase logarítmica a um A600 de 0,2 - 0,4. Para L. reuteri, isso é 1 mL de uma cultura noturna. Ajustar conforme necessário para outras espécies de interesse.
- Remova completamente o sobrenadante dos pellets celulares.
- Ressuspenda os grânulos celulares em 250 μL de tampão de lise GITC (isotiocianato de guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7) e lise por incubação a 95 ° C por 10 min. Armazene os lisados a -80 ° C.
NOTA: Seja consistente com o tempo de lise, pois a incubação prolongada em alta temperatura pode resultar na degradação do poliP por hidrólise. Os lisados podem ser armazenados indefinidamente a -80 °C.
CUIDADO: O isotiocianato de guanidina é um sal caotrópico e deve ser manuseado com luvas e descartado como resíduo perigoso.
2. Medindo o conteúdo proteico dos lisados celulares
- Prepare padrões de albumina de soro bovino (BSA) contendo 0, 0,1, 0,2 e 0,4 mg mL-1 de BSA no tampão de lise GITC.
NOTA: É importante fazer os padrões BSA no GITC, pois o GITC influencia o desenvolvimento da cor do ensaio de Bradford. Os padrões BSA podem ser armazenados indefinidamente a -20 °C. - Alíquota de 5 μL de lisados celulares descongelados e bem misturados e dos padrões BSA para separar os poços em uma placa transparente de 96 poços.
- Adicione 195 μL de reagente de Bradford a cada alvéolo e meça a absorbância a 595 nm (A595) em um leitor de placas (consulte a Tabela de Materiais).
- Calcule a quantidade de proteína em cada poço em comparação com a curva padrão BSA, usando a fórmula y = mx + b, onde y é A595, x é μg de BSA, m é a inclinação da curva padrão e b é a interceptação y da curva padrão. Multiplique o valor resultante por 0,05 para determinar o total de mg de proteína em cada amostra.
3. Extraindo polifosfato
- Adicione 250 μL de etanol a 95% a cada amostra lisada com GITC e vórtice para misturar.
- Aplicar essa mistura a uma coluna de centrifugação de membrana de sílica e centrifugar durante 30 s a 16,100 x g.
- Descarte o fluxo e, em seguida, adicione 750 μL de Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 5 mM, etanol 50% e centrifugue por 30 s a 16.100 x g.
- Descarte o fluxo e centrifugue por 2 min a 16.100 x g.
- Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e adicione 150 μL de Tris-HCl 50 mM (pH 8).
- Incubar à temperatura ambiente por 5 min e, em seguida, eluir o poliP centrifugando por 2 min a 8.000 x g.
NOTA: Se desejado, os eluatos podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 1 semana.
4. Digestão de polifosfato
- Prepare padrões contendo 0, 5, 50 ou 200 μM de fosfato de potássio em 50 mM de Tris-HCl (pH 8).
NOTA: Os padrões de fosfato de potássio podem ser armazenados indefinidamente em temperatura ambiente. - Alíquota de 100 μL de cada padrão de fosfato e de amostras de poliP extraídas em alvéolos separados de uma placa transparente de 96 poços.
- Prepare uma mistura principal contendo (por amostra): 30 μL de tampão de reação 5x ScPPX (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM de acetato de amônio, pH 7,5)13, 19 μL de H2O e 1 μL de ScPPX purificado (1 mg mL-1).
- Adicione 50 μL da mistura principal a cada poço da placa de 96 poços. Incubar por 15 min a 37 °C.
NOTA: Se desejado, as amostras de poliP digeridas podem ser armazenadas a -20 °C indefinidamente.
5. Detecção de fosfato livre
- Prepare a base da solução de detecção dissolvendo 0,185 g de tartarato de potássio e antimônio em 200 mL de água, adicionando 150 mL de 4 N H2SO4 e, em seguida, adicionando 1,49 g de heptamolibdato de amônio. Agitar para dissolver e depois levar a um volume final de 456 ml. Filtrar a solução para remover as partículas e conservar ao abrigo da luz a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
- Preparar uma solução-mãe de ácido ascórbico 1 M. Conservar protegido da luz a 4 °C até 1 mês.
- Prepare um novo estoque de solução de detecção todos os dias misturando 9,12 mL de base de solução de detecção com 0,88 mL de ácido ascórbico 1 M. Deixe a solução de detecção atingir a temperatura ambiente antes de usar.
- Adicione 50 μL de solução de detecção a cada amostra e padrão na placa de 96 poços e incube em temperatura ambiente por cerca de 2 min para permitir o desenvolvimento da cor.
- Meça a absorbância a 882 nm com um leitor de placas e calcule a concentração de fosfato de cada amostra em comparação com a curva padrão de fosfato de potássio.
CUIDADO: A solução de detecção contém sais tóxicos e ácidos fortes. Use luvas e trate o excesso de solução como lixo tóxico.
6. Cálculo do conteúdo de polifosfato celular
- Converta as concentrações de fosfato determinadas na etapa 5.5 em nanomoles de fosfato derivado de polyP em cada lisado de célula inteira de acordo com a seguinte fórmula:
nmol polyP = 1,5 x (μM de fosfato / 10)
NOTA: O método baseado em curva padrão na etapa 5 determina a concentração de fosfato (em μM) em cada amostra de 100 μL de poliP aliquotada na etapa 4.2. Para converter essa concentração em um número de nmol, 100 μL é dividido por 106 para dar um volume em L, multiplicado pela concentração (μmol L-1) e multiplicado por 1.000 (o número de nmol em um μmol). Isso se reduz a dividir a concentração por 10. O volume total do extrato preparado na etapa 3 é de 150 μL, portanto, é necessário multiplicar o valor resultante por 1,5 para calcular o nmol de fosfato presente em todo o extrato. - Normalizar o conteúdo de poliP celular em proteína celular total, dividindo nmol poliP pela mg de proteína total em cada amostra determinada na etapa 1.4. Os níveis de PolyP são expressos em termos da concentração de fosfato livre derivado de polyP individual.
NOTA: Em alguns casos, a quantidade de fosfato derivado de polyP presente em uma amostra pode estar fora da faixa linear da curva padrão de fosfato. Se os níveis de poliP forem muito elevados, o excesso de eluído contendo poliP do passo 3.6 pode ser diluído 1:10 ou 1:100, conforme necessário, e depois medido novamente conforme descrito nos passos 4 a 6.
