Este vídeo demonstra o pré-tratamento de macrófagos com vesículas de membrana externa (OMVs) de Legionella pneumophila para examinar seu efeito na replicação bacteriana. Ao alterar a sinalização imunológica do hospedeiro, os OMVs tornam os macrófagos mais permissivos à infecção. Contagens de colônias mais altas nas células tratadas, em comparação com as não tratadas, indicam que os OMVs promovem a replicação de L. pneumophila dentro dos macrófagos.
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Artigo de método
Ensaio da replicação de Legionella pneumophila em macrófagos pré-tratados com vesículas de membrana externa
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29 de agosto de 2025
Neste artigo
Resumo
Protocolo
1. Pré-trate macrófagos
- Prepare células THP-1 (células Tohoku Hospital Pediatrics-1, uma linha celular de leucemia monocítica humana).
NOTA: THP-1 é uma linha celular monocítica derivada de um paciente com leucemia.- Adicione 2x105 células THP-1 por 24 poços e diferencie-as adicionando 20 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) em células semelhantes a macrófagos. Incubar durante 24 h a 37 °C.
- Substitua o meio por 500 μL de meio fresco e incube por mais 24 h; o meio ideal para células THP-1 compreende Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640 glicose alta suplementada com 10% de soro fetal de bezerro.
- Isole os macrófagos derivados da medula óssea murina (mBMDM).
- Trate macrófagos derivados de THP-1 ou mBMDM com vesículas de membrana externa (OMVs).
- Descongele os OMVs e adicione-os aos macrófagos humanos ou murinos de acordo com sua quantidade de proteína (0,1, 1 e 10 μg/mL). Incubar os macrófagos com OMVs a 37 °C durante pelo menos 20 h.
2. Infecte os macrófagos e avalie a replicação bacteriana com um ensaio de unidade formadora de colônias (UFC)
- Use Legionella pneumophila, células THP-1 pré-tratadas ou mBMDM da etapa 4.3 e macrófagos não pré-tratados como controles (2x105/24 poços). Não troque o meio.
- Infecte células THP-1 com L. pneumophila Corby WT e mBMDM com um mutante sem flagelina de L. pneumophila Corby (ambos com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5; 1x105 L. pneumophila / 24 poços) e incube por 24 e 48 h, respectivamente.
- Lisar as células em seu meio pela adição de saponina (concentração final: 0,1%) e incubar a 37 ° C por 5 min.
- Ressuspender as bactérias pipetando e transferir a suspensão para um recipiente de reação. Prepare diluições seriadas do meio contendo L. pneumophila em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
- Risque 50 μL das diluições necessárias em placas de ágar extrato de levedura de carvão tamponado (BCYE) e incube por 3 dias a 37 ° C.
- Conte visualmente as colônias formadas. Calcule a CFU
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Normalize o resultado da contagem de UFC para macrófagos não pré-tratados, mas infectados, que são definidos como 100%.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha) | 82.1473 | |
| Carvão ativado | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha) | X865.2 | |
| Ágar-ágar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha) | 5210.2 | |
| Ágar Columbia com 5% de sangue de ovelha | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemanha) | 254005 | |
| Nitrato férrico nonahidratado | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha) | 5632.1 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemanha) | 10270-106 | |
| Heracell 240i Incubadora de dióxido de carbono | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha) | 40830469 | |
| Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha) | 75004515 | |
| Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha) | 86.1567.010 | |
| L. pneumophila Corby | --- | --- | Gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Antje Flieger (RKI, Berlim, Alemanha) |
| L. pneumophila Corby ΔflaA | --- | --- | Gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlim, Alemanha) |
| mBMDM | ------ | Gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Alemanha) e Prof. Dr. Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Alemanha) | |
| PBS | Biochrom GmbH (Berlim, Alemanha) | L 1825 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemanha) | P8139-1MG | |
| Agitador rotativo (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha) | SHKE6000 | |
| RPMI 1640 glicose alta | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Alemanha) | 11875-093 | |
| Saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha) | 9622.1 | |
| Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra) | 80-2116-30 | |
| THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemanha) | 88081201-1VL | |
| Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha) | ||
| Extrato de levedura | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha) | 2363.2 |
