Um procedimento para colheita bacteriana e lise mecânica

Resumo

Fonte: Mercier, N., et al. Purificação de afinidade MS2 acoplada ao sequenciamento de RNA em bactérias Gram-positivas. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para coletar células bacterianas e lisá-las mecanicamente para liberar conteúdo intracelular.

Protocolo

1. Colheita de bactérias

CUIDADO: Esta etapa envolve o manuseio de bactérias patogênicas.

1. Cultive uma colônia de cepas carregando plasmídeos pCN51-P3-MS2-sRNA ou pCN51-P3-MS2 em 3 mL de meio Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com eritromicina (10 μg/μL) em duplicatas.
2. Dilua cada cultura durante a noite em 50 mL (≈1/100) de meio BHI fresco suplementado com eritromicina (10 μg / μL) para atingir uma DO_{de 600 nm} de 0,05. Use frascos esterilizados de 250 mL (proporção de 5:1 frasco para meio).
   NOTA: As condições de meio e crescimento devem ser definidas de acordo com o padrão de expressão do sRNA estudado.
3. Cultive culturas a 37 ° C com agitação a 180 rpm por 6 h.
4. Transfira cada cultura para um tubo de centrífuga de 50 mL.
5. Centrifugar a 2.900 x g durante 15 min a 4°C. Rejeitar o sobrenadante.
6. Mantenha os pellets no gelo e execute diretamente a lise celular mecânica ou congele e armazene os pellets a -80 °C.

2. Lise celular mecânica

CUIDADO: As etapas a seguir devem ser executadas no gelo e os tampões devem estar a 4 °C. Use luvas e tome todas as precauções para proteger as amostras das RNases.

1. Ressuspenda os pellets (etapa 1.6) em 5 mL de tampão A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT).
2. Transfira as células ressuspensas em tubos de centrífuga de 15 mL com 3,5 g de esferas de sílica (0,1 mm).
3. Insira os tubos em um instrumento mecânico de lise celular. Execute um ciclo de 40 s a 4.0 m/s.
   NOTA: Se um ciclo não for suficiente para quebrar as células, deixe o dispositivo esfriar por 5 min enquanto mantém samples no gelo. Em seguida, repita outro ciclo de 40 s a 4,0 m/s. A eficiência da lise celular pode ser testada por plaqueamento do sobrenadante em placa de ágar BHI.
4. Centrifugar a 15.700 x g durante 15 min. Recuperar o sobrenadante e mantê-lo no gelo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
tubos de centrífuga de 15 mL	Falcon	352070
Tubos de centrífuga de 50 mL	Falcon	352051
frasco de cultura de 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Culturas
BHI (Infusão de Coração Cerebral)	Caldo Sigma-Aldrich	53286	Meio de crescimento
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Meio de crescimento
Matriz de lise B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lise mecânica
Solução RNAPro	MP Biomedicals	6055050	Lise mecânica
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals	116004500	lise mecânica
Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Culturas bacterianas

bacterianas Espectrofotômetro de