Isolamento de RNA alvo bacteriano ligado a RNA regulatório pequeno usando purificação de afinidade

Resumo

Fonte: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o isolamento de pequeno RNA regulador (sRNA) marcado com MS2 ligado ao seu RNA alvo bacteriano usando purificação de afinidade com uma fusão de proteína de ligação à maltose (MBP) – MS2 imobilizada em resina de amilose.

Protocolo

Tampões e meios

Para experimentos MAPS, prepare os seguintes tampões e meios:- Tampão A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)- Tampão E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)

Preparação da coluna

CUIDADO: Tenha cuidado para não deixar a resina de amilose secar. Se necessário, sele a coluna com uma tampa. Prepare todas as soluções antes de iniciar a purificação por afinidade.

1. Coloque uma coluna de cromatografia em um rack de colunas.
2. Remova a ponta da coluna e lave a coluna com água ultrapura.
3. Adicione 300 μL de resina de amilose.
4. Lave a coluna com 10 mL de tampão A.
5. Dilua 1.200 pmol de proteína MBP (proteína de ligação à maltose)-MS2 em 6 mL de tampão A e carregue-o na coluna.
6. Lave a coluna com 10 mL de tampão A.

Purificação por afinidade MS2 (Figura 1)

1. Carregue o lisado celular na coluna.
   NOTA: Mantenha 1 mL do lisado celular (extrato bruto, CE) para extrair o RNA total e realizar o Northern blot e a análise transcriptômica.
2. Recolha a fracção de passagem (FT) num tubo de recolha limpo.
3. Lave a coluna 3 vezes com 10 mL de tampão A. Colete a fração de lavagem (W).
4. Eluir a coluna com 1 ml de tampão E e recolher a fracção de eluição (E) num microtubo de 2 ml.
5. Manter todas as fracções recolhidas congeladas até à extracção do ARN ou congelá-las a -20 °C para utilização posterior.

Resultados

Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo MAPS adaptado para Staphylococcus aureus. Da construção do plasmídeo à análise de dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL tubo de microcentrífuga	Sarstedt	72.690.001
Tubos de centrífuga de 15 mL	Falcon	352070
Tubo de microcentrífuga de 2 mL	Starstedt	72.691
Frasco de cultura de 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Culturas
bacterianas Tubos de centrífuga de 50 mL	Falcon	352051	Centrifugação de cultura
Resina de amilose	New England BioLabs	E8021S	Purificação de afinidade MS2
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP produção
Coluna de cromatografia Poly-Prep	BioRad	7311550	Purificação por afinidade MS2