Isolamento de RNA alvo bacteriano ligado a RNA regulatório pequeno usando purificação de afinidade

Resumo

Fonte: Mercier, N., et. al., MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o isolamento de pequeno RNA regulador (sRNA) marcado com MS2 ligado ao seu RNA alvo bacteriano usando purificação de afinidade com uma fusão de proteína de ligação à maltose (MBP) – MS2 imobilizada em resina de amilose.

Protocolo

Tampões e meios

Para experimentos MAPS, prepare os seguintes tampões e meios:- Tampão A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)- Tampão E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)

Preparação da coluna

CUIDADO: Tenha cuidado para não deixar a resina de amilose secar. Se necessário, sele a coluna com uma tampa. Prepare todas as soluções antes de iniciar a purificação por afinidade.

1. Coloque uma coluna de cromatografia em um rack de colunas.
2. Remova a ponta da coluna e lave a coluna com água ultrapura.
3. Adicione 300 μL de resina de amilose.
4. Lave a coluna com 10 mL de tampão A.
5. Dilua 1.200 pmol de proteína MBP (proteína de ligação à maltose)-MS2 em 6 mL de tampão A e carregue-o na coluna.
6. Lave a coluna com 10 mL de tampão A.

Purificação por afinidade MS2 (Figura 1)

1. Carregue o lisado celular na coluna.
   NOTA: Mantenha 1 mL do lisado celular (extrato bruto, CE) para extrair o RNA total e realizar o Northern blot e a análise transcriptômica.
2. Recolha a fracção de passagem (FT) num tubo de recolha limpo.
3. Lave a coluna 3 vezes com 10 mL de tampão A. Colete a fração de lavagem (W).
4. Eluir a coluna com 1 ml de tampão E e recolher a fracção de eluição (E) num microtubo de 2 ml.
5. Manter todas as fracções recolhidas congeladas até à extracção do ARN ou congelá-las a -20 °C para utilização posterior.

Resultados

Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo MAPS adaptado para Staphylococcus aureus. Da construção do plasmídeo à análise de dados.

Materiais