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1. Preparação de cepas bacterianas ou bibliotecas mutantes
1. Riscar as estirpes a ensaiar em placas de ágar adequadas. Estas são placas de estoque para o experimento.
1. Incube as placas durante a noite na temperatura desejada para obter colônias únicas. Para este experimento, cultive K. pneumoniae (NTUH-K2044 e cepas ATCC43816) em ágar caldo Luria (LB) a 37 ° C, e S. pneumoniae (23F tipo selvagem e 23F Δcps) em ágar sangue em um frasco de vela umidificado a 37 ° C.
2. Escolha uma única colônia de um prato de estoque (etapa 1.1) para inocular 10 mL de caldo apropriado usando um laço estéril ou palito de coquetel. Para triagem de bibliotecas de mutantes aleatórios, inocular o caldo com 10 μL do estoque de biblioteca de mutantes aleatórios (Biblioteca TraDIS).
1. Incubar cepas de K. pneumoniae em meio LB com baixo teor de sal a 37 °C com agitação e cepas de S. pneumoniae em meio de infusão cérebro-coração (BHI), estaticamente a 37 °C.
2. Transfira a cultura durante a noite para um tubo de 15 mL e centrifugue em uma centrífuga de bancada por 10 min a 3.200 x g em baldes basculantes com inserções de tubo de 15 mL e tampas estanques em aerossol.
3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
NOTA: Descarte o sobrenadante por meio da rota apropriada de resíduos biológicos líquidos no laboratório. O objetivo das etapas de centrifugação e ressuspensão (1.2.2 e 1.2.3) é concentrar as bactérias para facilitar a visualização do gradiente. As culturas bacterianas podem ser carregadas diretamente no gradiente, se preferir. Cepas fortemente encapsuladas podem não formar um pellet apertado. Se isso ocorrer, remova o máximo de sobrenadante possível sem remover nenhuma célula bacteriana, adicione 1x PBS a um volume final de 5 mL e ressuspenda o pellet. Continue o protocolo com a etapa 1.2.5.
5. Centrifugue os tubos conforme descrito na etapa 1.2.2.
6. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de 1x PBS. As células agora estão prontas para uso.
NOTA: A densidade da suspensão de células bacterianas não é crítica, mas precisa ser suficiente para visualização no gradiente. Sugere-se um diâmetro externo mínimode 600 (densidade óptica a 600 nm) de 4.