Separação de bactérias por quantidade de cápsula usando um gradiente de densidade descontínuo

Resumo

Fonte: Feltwell, T., et.al. Separação de bactérias por quantidade de cápsula usando um gradiente de densidade descontínuo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso de um gradiente de densidade descontínuo para separar cepas bacterianas com base na quantidade de cápsulas. Ao centrifugar uma biblioteca mutante de transposon através do gradiente, bactérias com diferentes densidades de cápsula se localizam em camadas distintas. As frações separadas podem então ser coletadas para análise a jusante.

Protocolo

1. Adicionando células preparadas a gradientes e separação por centrifugação

1. Adicione 600 μL de células preparadas ao topo do gradiente no tubo muito lentamente e sem misturar a interface.
2. Coloque os tubos em adaptadores de tubo e pese os adaptadores e tubos combinados para garantir que estejam equilibrados.
   1. Coloque os adaptadores de tubo em um rotor de ângulo fixo dentro de uma centrífuga de bancada. Centrifugue por 30 min a 3.000 x g.
   2. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos, coloque-os em um rack adequado e fotografe os resultados como um registro.
3. Recupere as frações bacterianas para quantificação de ácido urônico ou extração de DNA.
   1. Se não forem necessárias aplicações a jusante, descarte as amostras/gradientes por meio da rota apropriada de resíduos biológicos líquidos no laboratório.
      NOTA: É importante validar a separação para novas espécies/cepas de bactérias. As fracções individuais do gradiente devem ser examinadas por microscopia, por ensaio de ácido urónico ou por outro ensaio quantitativo adequado para confirmar o fenótipo da cápsula de cada fração. Se o objetivo for separar com base na agregação ou no tamanho da célula, devem ser usados ensaios independentes apropriados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Centrífuga 5810R com rotor A-4-81 e baldes de 500ml	Eppendorf	5810 718.007
Adaptadores para tubos de 15 ml	Eppendorf	5810 722.004
Rotor angular fixo F-34-6-38	Eppendorf	5804 727.002
Adaptador de tubo de 2,6 - 7 ml	Eppendorf	5804 739.000
Centrífuga 5424 incluindo rotor FA-45-24-11	Eppendorf	5424 000.460
Tubo inferior redondo de polipropileno de 5 ml	Falcon	352063