Acoustophorese assistida por aptâmero para separação microfluídica de bactérias Gram-negativas

Resumo

Fonte: Choi, H. J., et al. Acustophorese Microfluídica para Separação Fluídica de Bactérias Gram-Negativas usando Grânulos de Afinidade Aptâmero. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o método de separação seletiva de bactérias Gram-negativas de uma amostra bacteriana mista usando microesferas revestidas com aptâmero e forças acústicas dentro de um chip microfluídico.

Protocolo

1. Configuração e operação da acoustoprese
   1. Conecte os tubos de polieteretercetona (PEEK) às duas entradas para injetar duas amostras e tampão, e às duas saídas para coletar e descarregar resíduos (Figura 1).
   2. Encha manualmente o canal de acoustophoresis microfluídico com água desmineralizada sem bolhas usando uma seringa de 10 mL.
   3. Prepare um controlador de pressão de precisão com dois ou mais canais de saída para controlar o fluxo de fluido. Em seguida, encha os frascos até a metade com amostra e tampão, respectivamente, com dois orifícios em suas tampas e conecte-os à entrada do chip.
      NOTA: Um controlador de pressão de precisão com dois ou mais canais de saída pode ser substituído por vários controladores de pressão de precisão. Na entrada do tampão, um tampão capaz de gerar um fluxo laminar que impede que a amostra se mova para o centro durante a injeção da amostra é injetado através de um controlador de fluxo.
   4. Depois de preparar o dispositivo, injete a amostra e o tampão aplicando uma pressão de 2 kPa na entrada da amostra e 4 kPa na entrada do tampão usando o dispositivo de controle de pressão de precisão.
      NOTA: Neste momento, para um fluxo laminar suave, a pressão de injeção do tampão deve ser maior do que a pressão de injeção da amostra. O fluxo é controlado por um controlador de fluxo fixado ao aspirador conectado ao canal de entrada.
   5. Concentre-se em um cordão usando o transdutor piezoelétrico (PZT) para movê-lo para o centro do canal microfluídico enquanto verifica através do microscópio.
      NOTA: Quanto maior o cordão, maior o efeito na forma de onda, por isso é mais fácil alinhar com o ponto do nó. Um gerador de funções com um amplificador aplica energia ao PZT para gerar uma onda senoidal no microcanal. Como as porções superior e inferior do microcanal são feitas de vidro, a onda senoidal gerada é refletida e cria um ponto de nó.
   6. Usando um gerador de função de canal único, gere uma frequência de ressonância de 3.66 MHz e amplifique um sinal típico em 16 dB (cerca de nove vezes) usando um amplificador de potência (Figura 1).
      NOTA: A frequência de ressonância do atuador deve corresponder ao tamanho do canal, porque o canal é quadrado, o PZT opera em uma frequência precisa para criar um único nó.
   7. Observe os processos de separação e enriquecimento no chip acustofluídico com um microscópio de fluorescência e uma câmera de alta velocidade operando a 1.200 fps (quadros por segundo).
   8. Quantifique e analise a presença ou ausência de bactérias Gram-negativas (GN) e bactérias Gram-positivas (GP) verificando as imagens tiradas com a câmera do microscópio de fluorescência das esferas ligadas a bactérias e bactérias descarregadas através das amostras de coleta e saída de resíduos.
      NOTA: Microesferas com tampão, bactérias e aptâmeros passam pelo canal principal, e as microesferas são alinhadas centralmente por meio de acoustopórese no chip induzida pelo PZT. Finalmente, as microesferas que se ligaram às bactérias GN são coletadas na saída de coleta e as bactérias não coletadas são descarregadas pela saída de resíduos.

Resultados

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br />Figura 1: Esquema do sistema acustofluídico usado para separar e coletar células. A amostra ou solução tampão é injetada na porta de entrada através do controlador de fluxo. Para centralização de esferas e separação de amostras, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 μm Microesferas revestidas com estreptavidina	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer affinity beads
Aptamer	Integrated DNA	Technologies GN3-6'RNA	para conjugação de bactérias
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Bactérias-alvo
Gerador funcional	GW Instek	AFG-2225	Gerar frequência
Câmara de alta velocidade	Photron	FASTCAM Mini	Observação da separação
KOVAX-SERINGA Seringa de 10 mL Koreavaccine		22G-10ML	Encher o canal de acoustophorese microfluídica com água desmineralizada sem bolhas.
Microscópio	Olympus Corp.	IX-81	Observação da separação
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Injectar ou recolher partículas
Transdutor piezoeléctrico	Fuji Ceramics	C-213	Gerar onda específica no canal
Amplificador	de potência Amplificador de pesquisa	75A250A	Amplificar frequência
Controlador de pressão/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Controlo do controlador de pressão/fluxo de ar