Ensaio in vivo para correlacionar a bioluminescência bacteriana com a densidade celular

Resumo

Fonte: Brodl, E., et al. Medição in situ e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a medição e correlação da bioluminescência com a densidade celular em bactérias transformadas. Uma única colônia bacteriana é usada para iniciar uma cultura líquida. A cultura é colocada em um poço na concentração celular desejada. Um antibiótico e um indutor são adicionados para expressar o gene necessário para a bioluminescência bacteriana. As leituras de absorbância e bioluminescência são feitas em intervalos regulares usando um leitor de placas.

Protocolo

1. Desenho, preparação e expressão do operon lux em Escherichia coli

Nota: Consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre os kits comerciais usados nesta seção.

1. Para transferir o operon lux para E. coli, escolha um vetor pET padrão com locais de restrição apropriados e gene de resistência a antibióticos de interesse (por exemplo, pET28a; NcoI, XhoI, canamicina).
2. Projete os fragmentos e primers sobrepostos para montagem de Gibson com base na sequência de DNA de Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. Configure uma reação padrão de reação em cadeia da polimerase (PCR) com os primers projetados e o DNA genômico isolado (ácido desoxirribonucléico) de Photobacterium mandapamensis 27561 como modelo.
   NOTA: O isolamento do DNA genômico da respectiva cepa bacteriana aumenta a eficácia da PCR.
4. Purifique o produto de PCR por meio da purificação da coluna de rotação.
5. Efectuar a digestão de restrição do vector isolado pET28a com NcoI e XhoI a 37 °C durante 45 min.
6. Purificar o vetor linearizado e os fragmentos de PCR por eletroforese em gel de agarose e subsequente purificação da coluna de rotação.
7. Determine a concentração de DNA de cada fragmento e do vetor linearizado e calcule as quantidades ideais para a montagem de acordo com o protocolo.
   NOTA: A eficácia da montagem depende do tamanho e número do fragmento e deve ser ajustada de acordo com o protocolo do fabricante.
8. Depois de combinar todos os fragmentos e o tampão num tubo de PCR, incubar a mistura de montagem numa máquina de PCR a 50 °C durante 1 h.
9. Transforme o produto vetorial montado de acordo com os protocolos de transformação padrão para transformação de plasmídeo bacteriano de E. coli em um sistema de E. coli apropriado para replicação de plasmídeo de alto rendimento (por exemplo, E. coli TOP10 ou XL-1).
10. Escolha as colônias da placa de transformação e listre novas placas para isolamento de DNA.
11. Isole o DNA do plasmídeo de acordo com protocolos padrão.
12. Para verificar a montagem correta do plasmídeo, incluindo todos os fragmentos, primeiro execute uma PCR de colônia de acordo com protocolos padrão usando primers específicos para cada fragmento montado.
13. Além da PCR da colônia e subsequente eletroforese em gel de agarose, prepare todos os vetores de montagem isolados para sequenciamento de DNA para verificar a montagem correta e as sequências de DNA corretas.
14. Transforme o plasmídeo verificado de acordo com os protocolos de transformação padrão para transformação de plasmídeo bacteriano de E. coli em um sistema de E. coli apropriado para produção de proteínas de alto rendimento (por exemplo, E. coli BL21).
    NOTA: Continue diretamente com o protocolo de expressão abaixo. Para armazenamento mais longo, recomenda-se a preparação de um estoque de glicerol.

2. Expressão de cepas de E. coli modificadas

1. Prepare uma cultura noturna (ONC) para expressão por inoculação de um volume apropriado de meio Luria-Bertani (LB) (por exemplo, 100 mL) com o estoque de glicerol previamente preparado das células E. coli BL21 transformadas com o plasmídeo montado ou diretamente de uma placa de transformação. Adicione 100 μL de canamicina (50 mg / mL; gene de resistência a antibióticos de pET28a) e incube o ONC a 37 ° C e 120 rpm em um agitador de incubadora durante a noite.
2. Inocule a cultura de expressão principal (por exemplo,., 800 mL de meio LB) com 8 mL de ONC e adicione 800 μL de canamicina (50 mg / mL).
3. Incubar a cultura principal a 37 °C e 120 rpm num agitador de incubadora até que a densidade celular atinja uma DO₆₀₀ de 0,6 - 0,8 (aproximadamente 2,5 h).
4. Reduza a temperatura de incubação para 28 °C.
5. Induzir a expressão proteica adicionando propil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,1 mM.
   NOTA: Testes empíricos mostraram que a redução da temperatura para 28 °C proporcionou a maior intensidade de luz.
6. Observe as células até que comecem a brilhar (aproximadamente 1 h).
   NOTA: Dependendo da finalidade da expressão, as células crescem até o dia seguinte e depois são colhidas, ou as células podem ser mantidas tremendo enquanto estiverem brilhando (máximo 48 h). A colheita das células e a purificação de quaisquer proteínas podem ser feitas de acordo com os procedimentos padrão.

3. Expressão de cepas bioluminescentes bacterianas

NOTA: As cepas bioluminescentes bacterianas requerem um meio de crescimento específico/meio artificial de água do mar para crescimento e produção de luz.

1. Prepare o meio artificial de água do mar composto por dois componentes de meio preparados separadamente.
   NOTA: As quantidades a seguir são para 1 L de meio líquido ou 1 L de meio de ágar.
   1. Para o meio artificial de água do mar, pesar os seguintes sais: 28,13 g de NaCl (cloreto de sódio), 0,77 g de KCl (cloreto de potássio), 1,60 g de CaCl₂ · 2H₂O (cloreto de cálcio di-hidratado), 4,80 g de MgCl₂ · 6H₂O (cloreto de magnésio hexa-hidratado), 0,11 g de NaHCO₃ (bicarbonato de sódio) e 3,50 g de MgSO₄ · 7H₂O (sulfato de magnésio hepta-hidratado).
   2. Adicione 1 L de água destilada e dissolva todos os componentes.
   3. Para o meio LB, pesar os seguintes ingredientes: 10 g de extracto de levedura, 10 g de peptona e, para as placas de ágar, mais 20 g de ágar.
   4. Adicione 250 mL de água da torneira e dissolva os componentes.
   5. Autoclave ambos os meios preparados separadamente a 121 °C por 20 min.
   6. Para placas de ágar, combine 250 mL de meio LB com 750 mL de meio artificial de água do mar diretamente após a autoclavagem e prepare as placas.
   7. Para meio líquido, combine 250 mL de meio LB com 750 mL de meio artificial de água do mar diretamente após a autoclavagem ou quando resfriado.
      NOTA: O meio artificial de água do mar pode ficar turvo devido à precipitação de sal.
2. Listre as cepas bioluminescentes bacterianas em placas de ágar médio de água do mar artificial e incube durante a noite a 24 - 30 ° C.
   NOTA: O armazenamento prolongado de cepas bacterianas é normalmente obtido através do congelamento dos estoques de glicerol da cultura bacteriana. As cepas devem sempre ser listradas em placas de ágar primeiro para garantir condições iniciais uniformes para todas as cepas, antes do uso para culturas líquidas, devido a uma fase de atraso no crescimento após o descongelamento.
3. Prepare um ONC inoculando 100 mL de meio artificial de água do mar com uma única colônia da placa. Incubar o ONC a 24 - 30 °C e 120 rpm em um agitador de incubadora durante a noite.
4. Inocular 800 mL de meio artificial de água do mar com 8 mL de ONC.
5. Incubar as células bacterianas a 24 - 30 °C e 120 rpm em um agitador de incubadora.
   NOTA: O perfil de intensidade de luz das bactérias bioluminescentes varia fortemente com a temperatura. Dependendo dos mecanismos reguladores da produção de luz da respectiva cepa bacteriana, a emissão de luz pode começar após aproximadamente 1 - 6 h.
6. Observe as culturas de células bacterianas até que comecem a brilhar (aproximadamente 1 - 6 h).
   NOTA: Dependendo da finalidade da expressão, as células são cultivadas até o dia seguinte e depois são colhidas, ou as células podem ser mantidas tremendo enquanto estiverem brilhando. A colheita das células e a purificação de quaisquer proteínas podem ser feitas de acordo com os procedimentos padrão.

4. Ensaio de atividade in vivo para cepas bioluminescentes bacterianas e cepas modificadasde E. coli

NOTA: O armazenamento prolongado de cepas é normalmente obtido através do congelamento dos estoques de glicerol da cultura bacteriana. As cepas devem sempre ser listradas em placas de ágar primeiro para garantir condições iniciais uniformes para todas as cepas, antes do uso para culturas líquidas, devido a uma fase de atraso no crescimento após o descongelamento.

1. Listre a cepa bacteriana bioluminescente desejada ou a cepa de E. coli modificada em uma placa de ágar e incube a 28 °C durante a noite.
   NOTA: A temperatura de incubação pode variar de cepa para cepa e deve ser avaliada empiricamente. Para poder comparar cepas bacterianas bioluminescentes e cepas modificadas de E. coli, as condições de crescimento devem ser idênticas.
2. Inocular 3 ml de meio com a respectiva estirpe com uma única colónia de uma placa de ágar e incubar as células a 28 °C e 180 rpm num agitador de incubadora durante aproximadamente 1 a 2 h.
3. Medir a densidade celular de uma diluição de 1:10 da cultura líquida a 650 nm. Calcule a proporção e o volume para cultura de 1 mL com um OD650 de 0,05.
   NOTA: O ensaio subsequente do leitor de placas determinará a densidade celular a 650 nm para evitar interferência pela emissão de luz das cepas.
4. Pipete o volume calculado de cultura e meio para uma placa de parede preta de 24 poços com fundo de vidro. Para a cepa de E. coli modificada, adicione 1 μL de canamicina (resistência a antibióticos do vetor pET28a) e 1 μL de IPTG (indução de expressão gênica) às amostras. Coloque uma tampa na placa para evitar a evaporação durante as medições.
   NOTA: Para garantir que o vetor pET28a contendo todo o operon lux não seja perdido pela cultura de E. coli, canamicina deve ser adicionada a cada amostra de E. coli nos poços da placa e para garantir que a produção de luz das células de E. coli possa ser medida, a expressão gênica deve ser induzida por IPTG. Para evitar interferência de diafonia e medição, placas de poço de parede preta com fundo de vidro e tampas transparentes mostraram os melhores resultados. No entanto, a diafonia pode ser observada e as posições dos poços devem ser escolhidas com cuidado.
5. Inicie a medição em um leitor de placas.
   OBS: O protocolo do leitor de placas é baseado em um script especialmente desenvolvido para este ensaio que combina duas medições, absorbância e bioluminescência. Os pontos de dados são coletados a cada 10 minutos com agitação permanente entre as medições e uma temperatura constante de 28 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit	New England Biolabs Inc.	E2621S	para 10 rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerase	Thermo Scientific	F530S
Q5 DNA de alta fidelidade polimerase	New England Biolabs Inc.	M0491S
GeneJet Kit de Purificação de DNA Genômico	Thermo Scientific	K0721	50 rxn
e tampão (NcoI, XhoI)	New England Biolabs Inc.	R3193S/R0146S
Kit de limpeza de gel e PCR Wizard SV	Promega	A9282	para 250 rxn
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs Inc.	#T1020S	para 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503	para 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polimerase	Promega	M7841
24 poços sensoplate preto com fundo de vidro	Greiner Bio One	662892
FLUOStar Omega leitor de placas	BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software	BMG Labtech		Versão 2.20
Microsoft Excel 2010	Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker	Infors AG

para enzimas de restrição de