Cultivo de bactérias Magnetospirillum e avaliação de seu comportamento magnetotático

Resumo

Fonte: Le Nagard, L., et al. Bactérias magnetotáticas em crescimento do gênero Magnetospirillum: Cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra como cultivar bactérias Magnetospirillum em condições microaeróbicas usando meios líquidos e semissólidos. Ele destaca a formação de uma banda bacteriana visível na interface óxico-anóxica e sua migração ascendente à medida que o oxigênio se esgota. O vídeo também mostra como avaliar o comportamento magnetotático observando a natação direcional em resposta a um campo magnético.

Protocolo

1. Inoculação de bactérias magnetotáticas (MTB)

NOTA: As culturas das cepas AMB-1, MS-1 e MSR-1 podem ser obtidas comercialmente (Tabela de Materiais).

CUIDADO: Execute todas as etapas a seguir em condições estéreis, sob a chama de um bico de Bunsen.

1. Inoculação das estirpes MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meio líquido
   1. Selar um frasco vazio de soro de 125 ml com uma rolha de borracha butílica e um selo de alumínio de crimpagem. Insira duas agulhas no frasco através da rolha e conecte uma seringa a uma delas. Conecte a seringa a um cilindro de O₂ através do mesmo tipo de tubo usado para a estação N₂.
   2. Deixe O₂ fluir pela garrafa por cerca de 30 min para garantir que todo o ar na garrafa seja substituído por O₂. Remova ambas as agulhas, permitindo uma leve sobrepressão no frasco e, em seguida, autoclave. Deixe o frasco esfriar até a temperatura ambiente antes de usar.
      NOTA: Para economizar tempo, execute as etapas 1.1.1 e 1.1.2 durante a preparação do meio e autoclave o frasco junto com o meio ou as soluções de estoque.
   3. Esterilize a parte superior das rolhas da garrafa média fresca e da garrafa de O₂ aplicando algumas gotas de solução de etanol a 70% em cima delas e passando-as pela chama de um bico de Bunsen.
   4. Usando uma seringa estéril e uma agulha, extraia 1 mL de O₂ do frasco de O₂ e transfira-o para o frasco médio fresco. Certifique-se de que a agulha se encaixa bem na seringa durante esta etapa para evitar qualquer ar na seringa.
   5. Se estiver usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, esterilize as rolhas do frasco de meio fresco e do frasco de cultura mais antigo aplicando algumas gotas de solução de etanol a 70% em cima deles e passando-os pela chama de um bico de Bunsen. Se estiver usando o inóculo de um tubo de cultura congelada, deixe-o aquecer até a temperatura ambiente com o tubo selado sob a chama de um bico de Bunsen.
   6. Se estiver usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, inocule 1 mL da cultura mais antiga no meio fresco. Se estiver usando o inoculado de um estoque congelado, inocule apenas 0,1 mL para diluir o glicerol ou dimetilsulfóxido (DMSO) usado no processo de congelamento. Em ambos os casos, use uma agulha estéril e uma seringa estéril.
   7. Incubar a cultura a 32 °C e inoculá-la em meio fresco após 4 a 7 dias.
2. Inoculação de MSR-1 em meio semi-sólido gradiente de O₂
   1. Verificar se o tubo de meio fresco apresenta uma interface óxico-anóxica (OAI) bem definida, materializada por uma interface rosa-incolor.
   2. Se o inóculo for proveniente de outra cultura semi-sólida com gradiente de concentração de O₂, colher as bactérias pipetando 50 μL da cultura com uma ponta de pipeta estéril colocada na banda formada pelas bactérias. Inocular lentamente essas bactérias no OAI no meio fresco (interface rosa/incolor), evitando perturbar a interface. Se o inóculo for proveniente de uma cultura congelada, proceda da mesma forma com 100 μL de inóculo.
   3. Fechar o tubo e deixar as bactérias crescerem entre 25 °C e 30 °C. Transferir para o meio fresco utilizando o mesmo procedimento antes de a banda de bactérias atingir a superfície do meio.

2. Observação das bactérias

1. Esterilize a rolha do frasco de cultura aplicando solução de etanol a 70% em cima dela e passando-a pela chama de um bico de Bunsen. Para um meio semi-sólido, abra o tubo sob a chama de um bico de Bunsen. Use uma agulha estéril e uma seringa estéril para extrair as bactérias.
2. Use o método de gota suspensa8 para garantir que as bactérias sejam magnéticas e móveis.
   NOTA: A microscopia de contraste de fase dá ótimos resultados, mas não é obrigatória. Ampliações que variam de 10X a 60X são adequadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC ATCC	31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
L-cisteína.HCl.H₂O	Seringas Sigma-Aldrich	C7880-100G
1,0 mL	Fischer scientific	B309659
25G x 1 agulhas	BD	305125
frascos de soro de 125 mL	Wheaton	223748
20 mm vedações de alumínio	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimper	Wheaton	W225303
Rolhas de borracha butílica	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Tubos Hungate	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Rolha de septo, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Tubos de cultura de vidro	Corning (VWR)	9826-16X