$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Prepare as diluições do painel MIC
- Prepare uma solução estoque não superior a 1.600 μg / mL de dalbavancina em dimetilsulfóxido puro (puro) (DMSO) em tubos estéreis de vidro ou plástico e use no mesmo dia da preparação ou armazene a -20 a -60 ° C ou menos para uso futuro em um freezer sem degelo. Tome em consideração a potência da dalbavancina, conforme previsto na documentação recebida com o pó ao pesar o pó.
- Dilua a diluição do estoque de forma semelhante ao esquema com DMSO puro em vidro estéril ou tubos de plástico. Utilizar uma pipeta para medir o diluente e outra pipeta para adicionar o stock inicial de dalbavancina ao primeiro tubo. Para cada concentração de estoque subsequente de dalbavancina, use uma nova pipeta.
- Prepare diluições finais de concentração de painel MIC 100X (concentrações intermediárias) com DMSO puro. Combine volumes apropriados de fonte e DMSO para atingir a concentração intermediária desejada (os volumes a serem usados dependerão do número de painéis MIC a serem feitos).
- Prepare 0,004% de P80: Prepare uma solução de estoque de trabalho fresca de 2% de P80 adicionando 0,1 mL de P80 a 4,9 mL de dH₂O. Esterilize passando por um filtro de 0,22 μm e use a solução no mesmo dia da preparação. Prepare o diluente de P80 a 0,004% fazendo uma diluição de 1:500 de 2% de P80 (por exemplo, 0,3 mL de P80 a 2% de P80 a 149,7 mL de CAMHB).
- Além disso, dilua as concentrações intermediárias 1:100 em caldo Mueller Hinton ajustado para cátions (CAMHB) suplementado com 0,004% (v/v) de polissorbato-80 (P-80) e/ou LHB (para estreptococos) adicionado ao dobro da concentração final porque a adição de inóculo resultará em uma diluição de 1:2.
2. Prepare os painéis MIC
- Dispense 50 μL de cada solução de dalbavancina preparada em poços apropriados do painel MIC e inclua o meio apenas em um poço (poço de controle de crescimento). Uma pipeta multicanal com pontas estéreis pode ser usada para esta etapa.
- Use os painéis imediatamente ou feche com filme plástico, coloque-os em sacos plásticos e coloque-os imediatamente em um freezer sem descongelamento a ≤ -20 °C (de preferência a ≤ -60 °C) até que seja necessário. Se forem usados painéis congelados, remova os lacres e coloque os painéis individuais na bancada do laboratório por 15 a 30 minutos (até que o conteúdo do poço seja descongelado) antes de prosseguir com a inoculação do painel.
3. Inocular painéis MIC, realizar pureza e configurar contagem de colônias
- Selecione várias colônias bem isoladas de um ágar sangue de 18 a 24 horas ou outra placa de ágar não seletivo. Toque o topo de cada colônia com uma alça ou cotonete estéril e transfira para 1–5 mL de CAMHB ou solução salina até que a turbidez seja equivalente a um padrão de 0,5 McFarland. Avalie a turbidez por comparação visual com o 0,5 McFarland ou com um dispositivo fotométrico.
- Dentro de 15 a 30 minutos após a preparação, dilua o inóculo 1:100 em CAMHB (100 μL em 10 mL de CAMHB). Para a maioria das bactérias testadas contra a dalbavancina, com exceção de S. pneumoniae, essa diluição fornecerá uma concentração final de 5 × 10⁵ UFC/mL (a faixa aceitável é de 2 a 8 × 10⁵ UFC/mL). Para S. pneumoniae, a concentração bacteriana baseada em uma comparação de turbidez com um McFarland de 0,5 é tipicamente consideravelmente menor. Portanto, dilua o inóculo 1:25 (400 μL em 10 mL de CAMHB + 10% de LHB).
- Dentro de 15 minutos após a preparação do inóculo, transfira 50 μL do inóculo final para cada alvéolo (com exceção do poço de controle de esterilidade) do painel MIC preparado. Uma pipeta multicanal usando pontas estéreis pode ser usada para esta etapa.
- Realize uma verificação de pureza transferindo e espalhando uma alíquota de 1 a 10 μL do poço de controle de crescimento positivo usando uma alça estéril para um ágar não seletivo (por exemplo, ágar tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha).
- Configure a contagem de colônias removendo 10 μL do poço de controle de crescimento com uma pipeta de canal único e ponta estéril e transferindo para 10 mL de solução salina (diluição 1:1.000). Misture e transfira 100 μL com uma pipeta de canal único e ponta estéril para um meio de ágar não seletivo adequado (por exemplo, ágar tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha) e espalhe por toda a superfície do ágar com uma alça estéril, repetindo duas vezes em direções diferentes para garantir uma distribuição uniforme do inóculo (diluição 1:10).
4. Incube painéis MIC, contagem de colônias e placas
- de pureza Sele cada painel MIC ou pilha de no máximo quatro painéis em um saco plástico com fita plástica ou com uma tampa plástica bem ajustada antes de incubar. Como alternativa, coloque um painel MIC vazio no topo da pilha de no máximo 4 painéis MIC Incubar painéis MIC em uma incubadora de ar ambiente a 35 ° C ± 2 ° C por 16 a 20 horas (estafilococos e enterococos) e 20 a 24 horas (estreptococos) dentro de 30 minutos após a inoculação. Incubar a contagem de colônias e as placas de pureza nas mesmas condições, exceto incubar estreptococos em uma incubadora de 5% de CO₂.
5. Leia as placas de contagem de CIM e colônias; Verifique a placa de pureza
- Leia o MIC como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nos poços, conforme detectado a olho nu.
- Conte as colônias na placa de contagem de colônias. Multiplique cada colônia pelo fator de diluição (1:10.000) (por exemplo, 50 colônias equivalem a 5 × 10⁵ UFC/mL). Um intervalo aceitável é de 20 a 80 colônias (2 a 8 × 10⁵ UFC/mL) e é usado como uma diretriz aproximada.
- Verifique a placa de pureza. Se todas as colônias forem semelhantes a cada colônia, o inóculo pode ser considerado puro. Se houver outras colônias presentes, existe a possibilidade de um contaminante estar presente no painel MIC e o teste deve ser repetido.