Visualização mediada por nanopartículas da remodelação endolisossômica em células infectadas por bactérias

Resumo

Fonte: Zhang, Y., et al. Aplicação de Nanopartículas Fluorescentes ao Estudo da Remodelação do Sistema Endolisossômico por Bactérias Intracelulares. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o uso de nanopartículas fluorescentes para visualizar a remodelação endolisossômica em células epiteliais humanas infectadas por bactérias intracelulares. Após a invasão bacteriana, os patógenos manipulam o citoesqueleto do hospedeiro e o sistema endolisossomal, formando vacúolos com projeções tubulares que alteram o transporte das vesículas. Nanopartículas marcadas com fluorescência são então usadas para rastrear essas alterações, permitindo imagens de alta resolução de eventos de tráfego intracelular induzidos por patógenos.

Protocolo

1. Cultura de células HeLa
   1. células HeLa que expressam permanentemente LAMP1-GFP (glicoproteína de membrana associada ao lisossomo 1-proteína fluorescente verde) são cultivadas no meio Eagle modificado de Dulbecco, ou DMEM com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
   2. Semeie as células a uma densidade de 50.000 por poço em uma lâmina de câmara de 8 poços (Ibidi) e incube durante a noite (O/N).
2. Cultura de Bactérias
   1. Use Salmonella enterica sorovar Typhimurium NCTC 12023 estirpe de tipo selvagem (WT). Para comparação, use cepas mutantes ΔssaV defeituosas no SPI2-T3SS e ΔsifA sem efetor chave SifA para SIF. Use cepas que abrigam o plasmídeo pFPV25.1 para expressão constitutiva de GFP.
      NOTA: As cepas bacterianas são rotineiramente cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) com a adição de 50 μg/ml de carbenicilina (WT) e LB com a adição de 50 μg/ml de carbenicilina e/ou 50 μg/ml de canamicina (ΔssaV, ΔsifA) necessários para manter os plasmídeos.
   2. Inocular uma única colónia de bactérias em 3 ml de LB com antibióticos apropriados e cultivar O/N a 37 ºC em condições de agitação para arejamento, depois diluir 1:31 em LB fresco e continuar o crescimento durante 3,5 horas. Nesse momento, as culturas atingem a fase logarítmica tardia e as bactérias são altamente invasivas. Um 'tambor de rolo' é conveniente para incubar culturas de tubos de ensaio com aeração.
3. Infecção de células HeLa por Salmonella e Nanopartículas de Ouro-BSA-Rodamina ou NPs Pulse Chase-marcação (ver Figura 1 para esquema)
   1. Meça OD₆₀₀ das bactérias subcultivadas e dilua para OD₆₀₀ = 0,2 em 1 ml Solução salina tamponada com fosfato ou PBS (~3 × 10⁸ ufc/ml), adicione quantidades adequadas de bactérias às células HeLa em lâminas de câmara de 8 poços para obter uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100.
   2. Incube por 30 min na incubadora de células, lave 3 vezes com PBS para remover bactérias não internalizadas (este ponto de tempo foi definido como 0 horas após a infecção ou 0 horas p.i.). Adicionar 300 μl de meio de cultura fresco contendo 100 μg/ml de gentamicina e conservar durante 1 hora. Em seguida, substitua o meio por meio fresco contendo 10 μg/ml de gentamicina durante o resto do tempo de incubação.
   3. Após incubação com meio de cultura contendo 100 μg/ml de gentamicina por 1 hora, o meio é substituído por meio de imagem (MEM de Eagle sem FCS, L-glutamina, vermelho de fenol e bicarbonato de sódio, com HEPES 30 mM, pH 7,4) contendo 10 μg/ml de gentamicina. NPs de ouro-BSA-rodamina são adicionadas às células HeLa para obter uma concentração final de OD₅₂₀ = 0,1. (Albumina de soro bovino ou BSA)
      NOTA: NPs de ouro-BSA-rodamina também podem ser adicionadas às células antes da infecção, ou em vários pontos de tempo p.i.
   4. Após 1 hora de incubação, remova o meio, lave 3 vezes com PBS e adicione 300 μl de meio de imagem fresco contendo 10% de FCS e 10 μg/ml de gentamicina pelo restante do tempo de incubação.
      NOTA: A duração da incubação pode variar dependendo da concentração de NPs e linhagens celulares usadas. Para os macrófagos RAW264.7, observamos que a incubação de 30 min com NPs na concentração de OD₅₂₀ = 0,05 permitiu internalização suficiente.

Resultados

Figura 1. Esquema para a preparação de células HeLa para imagens de células vivas. As células HeLa foram semeadas em lâminas de câmara, simuladas ou infectadas com várias cepas de Salmonella por 30 min, lavadas 3 vezes com PBS e ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de ouro	Sigma-Aldrich	520918
Albumina de soro bovino	Sigma	A2153
NHS-Rhodamine	Pierce	46406
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Sigma	H3375
Gentamicina	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
Carpenicilina	Roth	6344
Lâminas de câmara de 8 poços	Ibidi	80826	cultura de tecidos tratada, estéril