Cultivo de Mycobacterium tuberculosis em condições limitadas por ferro

Resumo

Fonte: Gupta, S., et al. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de Mycobacterium tuberculosis sob condições limitadas de ferro para induzir estresse de ferro e promover a secreção de sideróforos que suportam a sobrevivência bacteriana.

Protocolo

1. Cultivo de micobactérias em condições limitadas de ferro

1. Descongele 50 μL de um estoque congelado de glicerol a 15% de Mtb (Mycobacterium tuberculosis) e risque uma placa de ágar suplementada com enriquecimento de ADN (Albumina – Dextrose – NaCl) a 10% (5 g/L de albumina, 2 g/L de dextrose e 0,85 g/L de cloreto de sódio, 0,2% de glicerol e 0,05% de Tween-80). Incubar a placa a 37 °C até que as colónias sejam visíveis.
2. Inocular uma única colônia de Mtb em 2 mL de meio de caldo micobacteriano (Tabela de Materiais) suplementado com enriquecimento de ADN. Incubar com agitação a 37 °C.
3. Deixe a cultura Mtb crescer até a fase logarítmica tardia (OD₅₄₀ é ~ 0,8). Para verificar isso, meça o OD₅₄₀ usando um espectrofotômetro.
4. Espalhe 200 μL da cultura logarítmica tardia nas placas de ágar micobacteriano (Tabela de Materiais) suplementadas com glicerol a 0,2%, Tween-80 a 0,05% e ADN. Inocular pelo menos 5 placas. Incubar as placas a 37 °C até que o crescimento bacteriano seja visível como uma camada confluente. Isso leva ~ 1 semana para Mtb.
5. Molhe um cotonete estéril em LIMM (meio mínimo com baixo teor de ferro). Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar e inocular 100 mL de LIMM para preparar uma suspensão bacteriana concentrada com um OD₅₄₀ de ~ 1,0.
6. Diluir esta suspensão 10 vezes para 1 L com LIMM e dividi-la em dois frascos de plástico estéreis de 2 L, cada um contendo 500 mL de cultura.
7. Retire 2 mL de cultura e transfira-os para um tubo de cultura de 5 mL. Adicionar 10 μL de tiloxapol a 10% vol/vol.
8. Incubar as culturas a 37 °C durante 14 dias.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar Middlebrook 7H10	BD Difco	262710	Placas de ágar micobacteriano
Caldo Middlebrook 7H9	BD Difco	271310	Meio de caldo micobacteriano
Tubo de centrífuga de parede fina de polipropileno 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Tubo de centrífuga de parede fina de polipropileno 13x15 mm
Frascos de filtração a vácuo	CellPro	V50022	Unidade de filtro