Isolamento de vesículas extracelulares contendo sideróforo de Mycobacterium tuberculosis

Resumo

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o isolamento gradual de vesículas extracelulares (EVs) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas sob condições limitantes de ferro que imitam o ambiente hospedeiro. Ele descreve o uso de ultrafiltração, centrifugação diferencial e separação de gradiente de densidade para enriquecer e identificar frações contendo EV.

Protocolo

1. Coleta de Vesículas Extracelulares Micobacterianas (MEVs)

1. Meça a DO₅₄₀ da cultura de 2 mL no momento da coleta. Fazer diluições seriadas 1:10 da cultura e da placa 100 μL de cada diluição em placas de ágar com ADN e 0,05% de Tween-80.
2. Transfira a cultura para cinco tubos de centrífuga cônicos de 225 mL e centrifugue a 2.850 x g por 7 min a 20 °C.
3. Colete o sobrenadante de cultura com uma pipeta de 50 mL e esterilize-o por filtro através de uma unidade de filtro de 0,22 μm.

2. Isolamento de MEVs

1. Transfira o filtrado de cultura para um sistema de ultrafiltração de células agitadas colocado a 4 ° C e filtre o concentrado a <50 psi através de uma membrana de corte de 100 kDa para ~ 50 mL.
2. Centrifugar o filtrado de cultura concentrado a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C e recolher o sobrenadante.
3. Centrifugar o filtrado de cultura em tubos de ultracentrifugação de policarbonato a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C.
4. Ressuspenda os grânulos membranosos em um total de 1 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) por pipetagem suave.
5. Misture 0,5 mL da suspensão de pellets obtida na etapa 2.4 com 1,5 mL de solução de iodixanol a 60%, produzindo uma concentração final de iodixanol de 45% em peso / vol. Dispense esta mistura no fundo de um tubo de ultracentrífuga de polipropileno de parede fina de 13 mm x 51 mm.
6. Sobreponha a suspensão de MEV-iodixanol a 45% com 1 mL de soluções de iodixanol a 40%, 35%, 30%, 25% e 20% (vol/vol em PBS) e 1 mL de PBS na parte superior.
7. Centrifugar a 100.000 x g durante 18 h a 4 °C.
8. Colete as frações de gradiente de densidade de 1 mL começando de cima usando uma seringa de Hamilton de 1 mL.
9. Diluir cada fração coletada para 20 mL com PBS e centrifugar a 100.000 x g por 2 h a 4 °C.
10. Remova o sobrenadante e suspenda o pellet em 0,5 mL de PBS. Conservar este pellet a 4 °C.

Materiais