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1. Cepas bacterianas e condições de cultura
NOTA: As cepas bacterianas utilizadas neste estudo foram Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve e Bifidobacterium dentium.
1. Para E. coli, use uma alça estéril para inocular colônias individuais em 250 a 1.000 mL de caldo Luria-Bertani (LB) e incube aeróbica em uma incubadora agitada a 300 rpm e 37 ° C por 48 h antes de processar a cultura. Para a cepa MP1 de E. coli recombinante que contém p114-mCherryClyluc, adicione cloranfenicol ao ágar LB e ao caldo a uma concentração final de 17 μg / mL.
2. Para A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve e B. dentium, listrar em placas de ágar Brain Heart Infusion (BHI) e incubar anaerobicamente dentro de uma câmara anaeróbica de vinil. Inocular colônias individuais em 100 mL de caldo BHI pré-reduzido e incubar por 48 h anaeróbico.
2. Isolamento EV
1. Clarificação do meio de cultura bacteriana por centrifugação e filtração
1. Transfira as culturas de células bacterianas inoculadas na etapa 1 para limpar frascos de centrífuga de polipropileno de 250 mL ou 500 mL despejando. Centrifugue as garrafas em um rotor de ângulo fixo de grande capacidade a 4 °C e 5.000 × g por 15 min. Transfira o sobrenadante para frascos de centrífuga limpos por vazamento cuidadoso e centrifugue novamente a 10.000 × g por 15 min.
NOTA: Reutilize as garrafas após limpeza e descontaminação adequadas à biossegurança.
1. Se grandes pastilhas de células bacterianas estiverem presentes após a segunda centrifugação, repita a centrifugação em um frasco limpo para remover ainda mais as células.
2. Transfira o sobrenadante para um dispositivo de filtro acionado por vácuo de polietersulfona de 0,22 μm de tamanho apropriado por vazamento. Filtre conectando o dispositivo de filtragem a uma fonte de parede a vácuo. Se a taxa de filtragem cair significativamente, basta mover qualquer material não filtrado para um novo dispositivo. Conservar o meio filtrado a 4 °C durante a noite e continuar o protocolo no dia seguinte, se desejar.
NOTA: As centrifugações acima normalmente permitem o processamento de ~ 2x o volume indicado de cultura de células através de cada dispositivo. Por exemplo, um único dispositivo de filtro de 500 mL pode filtrar ~ 1.000 mL de cultura pré-centrifugada. Esses dispositivos normalmente não são reutilizados. O uso de filtros de seringa nesta etapa não é recomendado sem otimização, pois foram observadas perdas significativas com os modelos testados. Este é um ponto de parada potencial.
3. Verificar a remoção completa das células viáveis neste ponto, espalhando uma alíquota do sobrenadante filtrado em placas de ágar adequadas e garantir a ausência de quaisquer colónias após a incubação em condições óptimas para a estirpe bacteriana. Se forem detectadas bactérias, otimize ainda mais o procedimento acima realizando centrifugações e/ou filtrações adicionais.
2. Concentração do meio filtrado
1. Se estiver trabalhando com volumes significativamente >100 mL, vá para a etapa 2.2.2. Se estiver trabalhando com volumes de ~ 100 mL, carregue 90 mL de meio de cultura filtrado no reservatório de um dispositivo de ultrafiltração centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa de capacidade respectiva usando pipetas sorológicas. Sempre equilibre com um dispositivo de ultrafiltração correspondente e centrifugue em um rotor de balde oscilante a 4 ° C e 2.000 × g por intervalos de 15 a 30 minutos, até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em < 0,5 mL.
1. Complete o reservatório com qualquer meio de cultura filtrado restante. Se estiver "completando", remova o fluxo na parte inferior do dispositivo e reequilibre todos os dispositivos.
NOTA: Observou-se que o volume máximo de meio de cultura filtrado que pode ser concentrado usando esses dispositivos é <2 vezes o volume recomendado.
2. Se a viscosidade do meio concentrado no reservatório estiver visivelmente aumentada (material escuro e viscoso), diluir com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e reconcentrar por centrifugação para diluir quaisquer proteínas não EV menores que o MWCO de 100 kDa.
NOTA: Este é um ponto de parada potencial.
3. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação às proteínas, armazene a 4 ° C durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte, se desejar.
2. Se estiver trabalhando com volumes significativamente >100 mL, selecione um dispositivo de filtragem de fluxo tangencial (TFF) de tamanho apropriado (100 kDa MWCO) para acomodar o volume a ser processado.
NOTA: Dispositivos de filtragem para processamento de 100 mL a > 1.000 mL estão disponíveis comercialmente. A disponibilidade local, o custo e a compatibilidade com a bomba e a tubulação/conexões ditarão quais modelos específicos serão mais úteis. Até 2 L de meio de cultura foram processados com o dispositivo indicado na Tabela de Materiais antes da necessidade de limpar o filtro (consulte a etapa 2.3 abaixo para o protocolo de limpeza).
1. Monte um circuito de filtragem com tubulação # 16 de baixa ligação / baixa lixiviação, farpa de mangueira de 1/8 de polegada para adaptadores Luer, o dispositivo TFF e uma bomba peristáltica.
NOTA: Realize TFF dentro de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação da preparação de EV com bactérias ambientais.
2. À temperatura ambiente, comece a circular o meio filtrado e condicionado a aproximadamente 200 mL / min (mínimo 100 mL / min). Determine a RPM apropriada correspondente à vazão desejada bombeando 200 mL de PBS para um recipiente graduado. Ao circular em meio filtrado e condicionado, colete as moléculas <100 kDa que atravessam a membrana de ultrafiltração como resíduo em um recipiente separado.
NOTA: O exemplo abaixo assumirá um volume inicial de 2 L de cultura.
3. Continue a circular o meio condicionado até que seu volume seja reduzido para ~ 100-200 mL. Mova para recipientes menores conforme necessário. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular com a bomba, concentrando-se até 75-100 mL. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até um volume final de 25 ml. Diluir 2 vezes com PBS e continuar a circular até <10 mL.
4. Levante o tubo de alimentação para fora do reservatório de amostra e continue a bombear para purgar o filtro e recuperar a quantidade máxima de amostra.
NOTA: Este é um ponto de parada potencial.
5. Transfira a amostra concentrada para um tubo cônico e armazene durante a noite a 4 °C, se desejar. Como alternativa, continue com o protocolo.
6. Mova a amostra concentrada para um dispositivo de ultrafiltração centrífuga MWCO de 15 mL com capacidade de 100 kDa. Centrifugue em um rotor de balde oscilante a 4 ° C e 2.000 × g por intervalos de 15 a 30 minutos até que o volume do meio no reservatório superior tenha sido concentrado em <2 mL.
NOTA: Este é um ponto de parada potencial.
7. Transfira o meio concentrado para um tubo de baixa ligação às proteínas e armazene a 4 ° C durante a noite, continuando o protocolo no dia seguinte, se desejar.