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1. Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)
NOTA: O SEC é usado para aumentar a pureza das vesículas extracelulares (EVs) e remover proteínas não vesiculares.
- Use uma pequena coluna SEC (10 mL de volume de leito) para o isolamento de EVs de <100 mL de material de partida e uma coluna maior (47 mL de volume de leito) para o isolamento de EVs de >100 mL de material de partida.
NOTA: O exemplo abaixo listará os volumes da coluna maior, com os volumes da coluna menor entre parênteses. - Leve a coluna SEC e a solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente por várias horas. Estabilize a coluna SEC na posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Como alternativa, use suportes de coluna de cromatografia comercial.
- Antes de conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório de amostra, permitindo que 5 mL de PBS fluam através da frita e entrem em um recipiente de resíduos. Desaparafuse a tampa de entrada da coluna SEC, adicione 2 mL de PBS ao sample reservatório e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna enquanto o PBS está pingando pela frita (não aplicável para pequenas colunas SEC). NOTA: Esta etapa anterior evita que bolhas de ar fiquem presas na parte superior da coluna SEC. Se o ar estiver preso, remova o reservatório, bata na coluna para retirar a bolha de ar e repita o procedimento de conexão. Para a coluna menor, basta destampar a parte superior da coluna SEC e anexar o funil de amostra.
- Adicione 47 mL (10 mL) de PBS ao reservatório de amostra e destampe a parte inferior da coluna SEC. Permita que todo o buffer de amostra carregado flua pela coluna para equilíbrio. Descarte o fluxo.
- Carregue no máximo 2 mL (0,5 mL) de amostra no reservatório de amostra, descarte o fluxo e deixe a amostra entrar completamente na coluna.
- Adicione imediatamente PBS ao reservatório ou funil de amostra a um volume de 14,25 mL menos o volume da amostra (3 mL menos o volume da amostra, para a coluna pequena). Permita que a solução flua através da coluna e descarte essa quantidade igual ao volume vazio da coluna.
NOTA: Para uma amostra típica de 2 mL, a quantidade de PBS a ser adicionada ao reservatório ou funil de amostra será de 12,25 mL. - Posicione um microtubo de baixa ligação de 2 mL diretamente abaixo da coluna SEC. Adicione imediatamente 2 mL (0,5 mL) de PBS ao reservatório de amostra e deixe-o entrar na coluna. Rotule os primeiros 2 mL (0,5 mL) de fluxo contínuo como Fração 1. Continue a adicionar 2 mL (0,5 mL) de cada vez ao reservatório de amostra para coletar cada fração subsequente.
NOTA: A maioria dos EVs bacterianos eluem nas primeiras 5 frações. Durante a otimização, as primeiras 12 frações foram coletadas. - Armazenar as fracções a 4 °C para armazenamento a curto prazo (dias) ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo.