Transinfecção bacteriana in vitro de células T via formação de sinapse imunológica

Resumo

Fonte: Cruz-Adalia, A., et al. As células T capturam bactérias por transinfecção de células dendríticas. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a transinfecção bacteriana por meio de interações entre células T e células dendríticas específicas do antígeno. As células dendríticas infectadas por bactérias que apresentam peptídeo de ovalbumina são incubadas com células T, diretamente ou separadas por uma membrana. O contato direto permite a formação de sinapses imunológicas, permitindo a transferência bacteriana, enquanto a membrana impede a interação. O tratamento com gentamicina é então feito para eliminar bactérias extracelulares.

Protocolo

Nota: Os camundongos foram criados em alojamentos específicos livres de patógenos (SPF) e foram sacrificados por pessoal treinado e qualificado usando o método de inalação de dióxido de carbono (CO₂).
1. Diferenciação e infecção de células dendríticas (DCs) derivadas da medula óssea de camundongoNota: A Figura 1 resume esta primeira etapa. Todos os procedimentos devem ser realizados na coifa a partir deste ponto, utilizando apenas meios estéreis, instrumentos, ponteiras de pipeta e placas de cultura.

1. Diferenciação de DCs derivadas de medula óssea de camundongo
   1. Dissecar tíbias e fêmures de um camundongo C57/BL6 e transferi-los para um prato de plástico com 10 ml de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
   2. Corte cada epífise com tesoura estéril e exponha a medula óssea, que tem uma cor vermelha brilhante característica.
   3. Infundir o interior do osso com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (tampão PBS/BSA/EDTA) usando uma seringa estéril em uma placa de Petri estéril.
   4. Recolher a suspensão de células e centrifugar num tubo a 600 x g numa centrifugadora refrigerada (4 °C).
   5. Ressuspenda as células em 1 ml de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) (0,15 M de cloreto de amônio (NH₄Cl), 10 mM de bicarbonato de potássio (KHCO₃) e 0,1 mM de EDTA) e incube por 30 segundos à temperatura ambiente (RT) para eliminar os glóbulos vermelhos.
   6. Adicione 10 ml de meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e filtre através de um filtro de células (70 μm) para remover fragmentos ósseos e aglomerados de células antes de centrifugar na mesma velocidade (600 xg) porque os aglomerados foram eliminados por filtragem.
   7. Contar as células e ajustar para 5 x 10⁵ células/ml com RPMI 10% FBS (contendo 50 μM de B-mercaptoetanol, 1 mM de piruvato de sódio) e adicionar 20 ng/ml de fator estimulador de colónias de granulócitos murinos-macrófagos recombinantes (rm-GM-CSF) como concentração final.
   8. Adicione esta suspensão a uma placa de Petri estéril de qualidade microbiológica de 15 cm e cultive em uma incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO₂).
   9. A cada três dias, descasque as células não aderentes e as células destacadas com 5 mM de EDTA em PBS e ressuspenda a 5 x 10⁵ células / ml de densidade celular, com meio fresco contendo 20 ng / ml rm-GM-CSF.
2. Maturação de DCs e carga de antígeno
   1. No dia 9, ressuspenda as células a uma densidade de 5 x 10⁵ células/ml em um meio contendo 20 ng/ml rm-GM-CSF. Em seguida, adicione 20 ng/ml de lipopolissacarídeo (LPS) para permitir a alta expressão do Complexo Principal de Histocompatibilidade ou MHC-II nas células e incube em uma placa de Petri estéril de 15 cm não tratada com cultura de tecidos por 24 horas.
   2. Após um dia de estimulação com LPS, core algumas células DC com anticorpos contra CD11c, MHC-II e receptor de granulócitos-1 ou Gr-1 de camundongo para verificar a diferenciação DC por citometria de fluxo. Um exemplo de análise por citometria de fluxo de DCs é mostrado nas Figuras 3A e 3B.
      1. Incubar DCs (5 x 10⁵ células/amostra) com um anticorpo monoclonal anti-camundongo-CD16/CD32 a 2,5 μg/ml de concentração final em 50 μl de tampão PBS/BSA/EDTA por amostra. Em seguida, adicione 50 μl dos anticorpos contra MHC-II (I-A/IE), CD11c e Gr-1 conjugados com diferentes fluorocromos a 1:100, 1:200 e 1:500 em tampão PBS/BSA/EDTA, respectivamente.
      2. Por fim, lave as DCs com tampão PBS/BSA/EDTA e analise por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante.
         Nota: Se as células estiverem bem diferenciadas, elas estão prontas para o carregamento do antígeno.
   3. Lave as DCs com RPMI 10% FBS (sem antibióticos) e incube-as com 10 μg / ml de peptídeo OTII de ovoalbumina (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) em um tubo plástico em 1 ml de meio RPMI 10% FBS por 5 x 10⁶ DCs por um mínimo de 1 hora a 37 ºC. Como controle negativo, deixe as DCs sem incubar com OVAp.
3. Infecção de DCs
   1. Infecte DCs em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 bactérias (10 bactérias por DC) por 1 hora em uma incubadora de CO₂ (37 ° C, 5% CO₂).
   2. Lave as células DC 3x em PBS e 1x em RMPI 10% FBS e centrifugue a 450 x g para lavar a maioria das bactérias extracelulares. Finalmente, ressuspenda as células em meio RMPI 10% FBS (sem antibióticos) a 20 x 10⁶ células / ml.

2. Isolamento de linfócitos T CD4 ⁺ de camundongos transgênicos OTIInota: A Figura 1 resume esta segunda etapa. Os linfonodos devem ser usados em vez do baço para isolar as células T CD4⁺ , porque a proporção de linfócitos CD4⁺ nos linfonodos (~50%) é maior do que no baço (~25%) e, portanto, a purificação seria mais eficaz.

1. Faça uma suspensão unicelular dos gânglios linfáticos
   1. Remova os linfonodos inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesentéricos de camundongos transgênicos OTII e transfira-os para um prato de plástico com 10 ml de meio RPMI 10% FBS.
   2. Triture os gânglios linfáticos sob um capuz estéril usando duas lâminas de microscópio foscas. Coloque os gânglios linfáticos em um lado fosco de uma lâmina de microscópio e esfregue com o lado fosco da segunda lâmina até que os órgãos tenham sido moídos.
   3. Lave a suspensão de célula única em tampão PBS/BSA/EDTA.
   4. Filtrar as células através de um filtro de células (70 μm) para remover o tecido conjuntivo e lavar com tampão PBS/BSA/EDTA.
   5. Ressuspenda as células em 1 ml de tampão de lise ACK e incube por 1 min em RT para eliminar os glóbulos vermelhos.
2. Isolamento de células T CD4⁺
   1. Lave novamente como na etapa 2.1.3 e conte as células para ressuspendê-las a 100 x 10⁶ células / ml em PBS / BSA / EDTA tampão. Adicione anticorpos biotinilados contra CD8, IgM, B220, CD19, MHC classe II (I-Ab), CD11b, CD11c e DX5 a 1:250 por 30 min em gelo para posterior seleção negativa de células T CD4⁺ .
   2. Lave as células em tampão PBS/BSA/EDTA e incube as células (100 x 10,⁶ células/ml) com microesferas de estreptavidina na concentração recomendada no protocolo do fabricante por 15 min no gelo.
   3. Lave as células em tampão PBS/BSA/EDTA e filtre-as através de um filtro de células (30 μm) antes do isolamento das células T CD4⁺ .
   4. Isolar as células T CD4⁺ por seleção negativa usando uma máquina de separação de células magnéticas de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Conte as células e ajuste para 4 x 10⁶ células / ml com meio RPMI 10% FBS (sem antibióticos).
   6. Fixar e manter em gelo células T CD4⁺ isoladas (3 x 10⁵ células) para verificar a pureza por citómetro de fluxo. Um exemplo de purificação de células T CD4⁺ é mostrado na Figura 3C.

3. Medição da transinfecção de células T por ensaio de proteção com gentamicinaNota: A Figura 2 resume esta terceira etapa do protocolo.

1. Transinfecção de células T

1. Incubar células T CD4 ⁺ isoladas com células DC infectadas (1: 1) (as DCs foram infectadas por 1 hora e lavadas para eliminar bactérias livres) por 30 min para permitir a formação de sinapses imunes em uma incubadora de CO₂ (37 ° C, 5% CO₂).

2. Adicione 0,5 ml de células T CD4 ⁺ isoladas (2 x 10⁶ células) e 0,1 ml de DCs infectadas (2 x 10⁶ células) em uma placa de cultura de 24 poços. Como controle negativo, infecte diretamente 0,5 ml de células T CD4⁺ em um MOI de 10 bactérias por 30 min.

3. Incluir controles adicionais separando DCs infectados de células T usando uma barreira transwell de policarbonato (com 3 μm de tamanho de poro), impedindo o contato físico DC-T. Adicione 0,1 ml de DCs dentro do transwell e 0,5 ml de células T CD4⁺ no compartimento inferior do poço (placa de 24 poços).

4. Finalmente, complete com meio RMPI até que haja 0,6 ml em cada poço para fazer volumes iguais em todas as amostras.

5. Após 30 minutos de formação de sinapses imunes, adicione 100 μg/ml de gentamicina e incube por 1 hora antes de coletar células em uma incubadora de CO₂ (37°C, 5% de CO₂).

Resultados

Figura 1. Fluxograma de geração de DC e isolamento de células T CD4⁺ . No lado esquerdo da figura, o processo para diferenciar as células dendríticas (DCs) das células da medula óssea é detalhado. Após a dissecação dos fêmures e t...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
RPMI	Fisher Científico	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Piruvato	Thermo Científico	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript	---
Filtro de célula 70uM	BD	352350
Seringa 30uM Filcons Estéril	BD	340598
AutoMacs Clássico	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicina	Norma	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Ágar	Pronadisa	1800
Paraformaldeído 16%	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710
Tritão X-100
Biot CD8	BD Biociências	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biociências	553086
CD19 biot	BD Biociências	553784
Biot MHC-II (I-A/I-E)	BD Biociências	553622
Biot CD11b	Immunostep	11BB-01mg
Biot CD11c	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biociências	553856
Gr-1 biot	BD Biociências	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biociências	553802
CD4-APC	Tonbo Biociências	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biociências	553129
MHC-II (I-A/IE) FITC	BD Biociências	553623
Alexa-Fluor 647 Anticorpo IgG (H+L) de Coelho para Cabras, altamente adsorvido	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina)	Tecnologias de vida	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Microesferas de estreptavidina	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biociências	---