Ensaio de fototaxia de cianobactérias filamentosas usando iluminação de luz focalizada

Neste artigo

Resumo

Fonte: Weber, N. et. al., Transformação Natural, Expressão de Proteínas e Crioconservação da Cianobactéria Filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra um ensaio focado baseado em LED para estudar fototaxia em cianobactérias filamentosas. As bactérias migram em direção à fonte de luz, formando um acúmulo denso no centro iluminado, que é visualizado e quantificado por meio da análise da intensidade de pixels da imagem capturada.

Protocolo

Ensaio para fototaxia
1. Para experimentos de fototaxia, prepare suportes de diodo emissor de luz (LED) (aqui, com uma impressora 3D) nos quais os LEDs de 5 mm selecionados são montados para irradiar uma área de 20 mm² de baixo para cima (Figura 1). Se necessário, use vários suportes de LED em paralelo, conectando cada LED eletricamente por meio de um resistor e potenciômetro a uma fonte de alimentação ajustável. Meça e ajuste as intensidades do LED, dependendo do experimento. Certifique-se de que todo o cenário esteja em uma sala escura ou em um recipiente fechado e escuro.
2. Colocar 8 ml do meio que contém lacuna de Phormidium numa placa de Petri de 6 cm. Ajuste a intensidade da luz do LED. Feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED fique no centro da placa de Petri.
3. Após a duração desejada (normalmente 2 dias), capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone apontada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um painel de LED branco para irradiação da amostra. Use as configurações manuais da câmera; evitar reflexos de luz; Sempre ajuste para obter a mesma distância entre a lente da câmera e a amostra. Certifique-se de que as configurações de exposição forneçam uma imagem adequada para análises posteriores usando ImageJ.
4. Quantifique o diâmetro do círculo central dos filamentos usando o software ImageJ.
  1. Abra o ImageJ, clique em Arquivo | Abra, selecione o arquivo desejado e clique em Enter.
  2. Selecione o botão Reto (com uma linha reta). Pressione o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri para a extremidade oposta. Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos.
  3. Pressione Ctrl-K no teclado ou clique em Analisar | Plotar perfil no menu ImageJ. Procure uma janela xy com intensidades de pixel plotadas em relação à distância - um perfil 1D da placa de Petri. Certifique-se de que a intensidade de pixel mais baixa esteja ligeiramente acima de 0 e o valor mais alto esteja abaixo de 255.
  4. Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel no círculo. Na posição y entre esses valores, estime os valores de x de ambos os lados do círculo apontando com o mouse para essas posições. Anote os dois valores e calcule a diferença.
  5. Obtenha o valor x mais alto apontando o mouse para o eixo y à direita. Observe que este valor e representa o diâmetro da placa de Petri. Se este diâmetro for de 5 cm, calcular o diâmetro do círculo central do filamento em d/e × 5 cm.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Figura 1: Experimento de fototaxia. Esquerda: Suporte de LED com 4 LEDs vermelhos, conectado a uma fonte de alimentação ajustável. No topo de cada LED, há uma placa de Petri de 6 cm com 8 mL de uma cultura de lacuna de Phormidium. Direita: placa de Petri ...