Avaliação da ligação pneumocócica a células endoteliais humanas primárias sob fluxo constante de meios

Resumo

Fonte: Jagau, H. et al. Infecção por pneumococo de células endoteliais humanas primárias em fluxo constante. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a visualização em tempo real da ligação pneumocócica às cadeias do fator de von Willebrand (FVW) em células endoteliais sob condições de fluxo de meio constante. Ele descreve as etapas para estimular a liberação de FVW, rotular as cordas e quantificar a ligação bacteriana.

Protocolo

1. Indução da liberação do fator de von Willebrand (VWF) e visualização de cordas VWF multimerizadas

1. Mantenha a configuração de fluxo porque uma tensão de cisalhamento de 10 din/cm² é necessária para acionar a multimerização do VWF em longas cadeias de até 200 MDa. Induza a liberação de FVW do WPB endotelial injetando 136 μL de uma solução estoque de histamina 100 mM no meio de crescimento de células endoteliais com meio de mistura de suplemento (ECGMS) circulando no tubo de perfusão usando uma porta de injeção. A concentração final de histamina no meio de fluxo será de 1 mM. Se nenhuma porta de injeção estiver disponível, a histamina pode ser adicionada alternativamente pipetando no meio dos reservatórios da bomba.
2. Para detecção de imunofluorescência de cadeias de FVW multimerizadas, interrompa o fluxo quando um nível médio equilibrado nos reservatórios for atingido e injete 20 μg de um anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína específico para FVW (FITC) em um volume de 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) nos 13,6 mL circulantes de meio ECGMS usando uma porta de injeção. Se não estiver disponível uma porta de injecção, o anticorpo pode ser adicionado alternativamente pipetando para o meio dos reservatórios da bomba. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1,3 μg / mL.
3. Para varredura microscópica de vários campos de visão em um curto espaço de tempo, use a unidade de fluorescência do microscópio com um dispositivo de fluorescência de xenônio com 30% de potência e uma câmera de epifluorescência. Monitore a forma e a morfologia da camada de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) com o modo de campo claro para selecionar células representativas adequadas para a visualização de cordas VWF.
4. Para visualização de cadeias de VWF fluorescentes verdes, selecione uma objetiva de óleo 63x/1,40 e um filtro de detecção de 470 nm no menu da unidade de fluorescência do software do microscópio (LasX). Crie instantâneos de pilhas Z de pelo menos 50 visualizações de campo representativas, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactas. Para quantificação das cadeias de FVW fluorescentes verdes em diferentes pontos de tempo, faça a varredura de vários campos de visão.

2. Avaliação microscópica da ligação bacteriana a cordas de FVW em fluxo em tempo real

1. Quantifique a ligação pneumocócica às cadeias de FVW geradas nas superfícies das células HUVEC por meio da detecção de imunofluorescência.
   1. Mantenha o fluxo e injete pneumococos que expressam proteína de fluorescência vermelha (RFP) 1,35 x 10⁸ UFC/mL em um volume máximo de 1 mL no meio ECGMS usando a porta de injeção. Em alternativa, pipete as bactérias para o meio no reservatório da bomba. Reinicie a tensão de cisalhamento a 10 din/cm² para permitir que as bactérias circulem dentro do sistema de bombeamento.
   2. Selecione uma objetiva de imersão em óleo de 63x para ampliação do microscópio e ajuste as configurações do filtro de fluorescência no software do microscópio para o canal RFP (filtro de detecção de 540 nm) para a detecção de pneumococos que expressam RFP.
   3. Para quantificação da ligação bacteriana às cadeias de FVW, interrompa o fluxo e crie instantâneos de pilhas Z de pelo menos 30 vistas de campo representativas, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactas, e conte o número de pneumococos.
   4. Use o algoritmo de estatística unifatorial ANOVA para avaliar os dados, seguido por um teste post hoc de amostra não pareada bicaudal para comparação estatística detalhada. Valores de p de <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Materiais