Imagem de fluorescência de infecção bacteriana associada a biomateriais em embriões de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Zhang, X., et al. Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra imagens de fluorescência de embriões de peixe-zebra injetados com Staphylococcus aureus, permitindo a quantificação da progressão da infecção e distribuição bacteriana para avaliar o impacto das microesferas de biomateriais nas interações patógeno-hospedeiro in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Microscopia de fluorescência da progressão da infecção e infiltração celular provocada em embriões de peixe-zebra

1. Anestesie os embriões colocando-os em uma placa de Petri de 100 mm contendo 0,02% (p / v) de ácido 3-aminobenzóico (Tricaína) para anestesiar Após 5 min, transfira os embriões para a placa de agarose revestida com meio E3 contendo 0,02% (p / v) de tricaína e alinhe-os em uma orientação para injeção. Pipete 500 μL de uma solução de metilcelulose PBS (solução salina tamponada com fosfato) a 2% (peso) em uma placa de Petri contendo meio E3 com 0,02% (p / v) de tricaína. Colocar os embriões na solução de metilcelulose e mantê-los retos e horizontais.
   NOTA: A solução de metilcelulose é usada como uma "cola", que devido à sua viscosidade, pode imobilizar temporariamente os embriões na melhor orientação para a imagem.
2. Use um microscópio de fluorescência estéreo equipado com filtros de campo brilhante, mCherry, proteína fluorescente verde (GFP) e UV (ultravioleta) para obter imagens de embriões individuais sob configurações otimizadas idênticas (por exemplo, intensidade, ganho e tempo de exposição) com ampliação de 160x. Defina o plano focal de modo que o dano tecidual causado pela injeção esteja em foco, usando o filtro de campo claro. Defina a profundidade da pilha Z em 10 μm e o tamanho do passo em 5 μm, o que permite a gravação de 3 imagens consecutivas.
3. Imagem de embriões individuais uma vez ao dia de 5 h após a injeção até 2 dias após a injeção. Exclua embriões mortos (sem batimentos cardíacos ou embrião parcialmente degradado) para imagens e análises adicionais. Manter os embriões individualmente em meio E3 em placas de 48 poços. Atualize o meio diariamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microesferas de poliestireno de 10 μm de diâmetro (fluorescente azul)	Tecnologia da vida/ThemoFisher	Rolamento F8829
Ácido 3-aminobenzóico (tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Microscópio fluorescente estéreo LM80	Leica	MDG3610450126
Metilcelulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Placa de Petri	Falcão	353003
Placa de Petri	Biomerieux	NL-132
ImagemJ	Não aplicável	Não aplicável	Link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prisma	Não aplicável