Análise in vivo de infecções bacterianas associadas a implantes usando embriões de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Zhang, X. et. al., Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um modelo de embrião de peixe-zebra para estudar infecções ligadas a biomateriais implantados. A injeção de Staphylococcus aureus com microesferas de poliestireno aumenta a sobrevivência bacteriana, confirmando o papel promotor de infecção dos materiais implantados.

Protocolo

1. Preparação de suspensões somente de bactérias e microesferas de bactérias

NOTA: A cepa Staphylococcus aureus RN4220 que expressa a proteína fluorescente mCherry (S. aureus-mCherry) é usada. A cepa S. aureus RN4220 sofre mutação no gene regulador de virulência agrA (regulador do gene acessório A) e, portanto, pode ter virulência relativamente baixa no modelo de embrião de peixe-zebra. Outras cepas de S. aureus ou outras espécies bacterianas para infecção associada a biomateriais (BAI) podem ser usadas.

1. Pegue 4 a 5 colônias de bactérias S. aureus RN4220 de placas de cultura de ágar soja tríptica suplementadas com 10 μg / mL de cloranfenicol e cultive a bactéria até a fase de crescimento logarítmico médio em 10 mL de caldo de soja tríptico suplementado com 10 μg / mL de cloranfenicol a 37 ° C sob agitação.
   1. Durante a cultura, diluir 100 μL da suspensão bacteriana em 900 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) em uma cubeta (largura de 1 cm) para uma medição da densidade óptica (DO) a 620 nm (OD₆₂₀). Cultive as bactérias até que o OD₆₂₀ atinja 0,4–0,8.
      NOTA: Uma DO₆₂₀ de 0,1 geralmente corresponde a 3,0 x 10⁷ unidade formadora de colônias (UFC)/mL de S. aureus. O OD₆₂₀ de um inóculo de bactérias na fase de crescimento logarítmico médio está entre 0,4-0,8. Diferentes períodos de tempo para cultura podem ser necessários para outras espécies e cepas de bactérias.
2. Centrifugue as bactérias a 3.500 x g por 10 min e ressuspenda as bactérias peletizadas em 1 mL de PBS estéril. Em seguida, lave as bactérias com PBS estéril 2 vezes e, finalmente, ressuspenda as bactérias em 1,1 mL de solução de polivinilpirrolidona40 (PVP40) a 4% (p / v) em PBS.
3. Vortex esta suspensão bacteriana e diluir 100 μL da suspensão em 900 μL de PBS estéril em uma cubeta para a medição OD₆₂₀ . Ajuste a concentração da suspensão bacteriana com solução de PVP40. Esta é a suspensão "somente bactérias".
4. Os biomateriais podem ser escolhidos livremente para se misturar com a suspensão bacteriana. No presente estudo, são utilizadas microesferas comerciais de poliestireno (PS) (fluorescente azul, 10 μm). Para gerar uma suspensão de microesferas de bactérias, centrifugue as microesferas por 1 min a 1.000 x g, temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e ressuspenda as microesferas na suspensão "somente bactérias" (em solução de PVP40).
5. Para injetar doses aproximadamente iguais de bactérias na presença e na ausência de microesferas, a concentração da suspensão Bactérias-Microesferas precisa ser dois terços da concentração da suspensão "Somente bactérias" (sem microesferas). Isso é conseguido diluindo a suspensão de Bactérias-Microesferas com 0,5 volume de solução de PVP40. Misture as suspensões por vórtice. É importante notar que essa proporção (dois terços) foi avaliada para S. aureus. Também é apropriado para S. epidermidis, mas é aconselhável verificar se essa proporção também se aplica a outras espécies bacterianas e outros tamanhos (que 10 μm) ou formas de biomateriais (que microesferas) a serem injetados.
6. Verifique a concentração da suspensão "Somente bactérias" e Bactérias-Microesferas por cultura quantitativa de diluições seriais de 10 vezes conforme abaixo: transfira 100 μL das suspensões para uma placa de 96 poços e dilua em série transferindo alíquotas de 10 μL da suspensão para 90 μL de PBS estéril. Duplicar alíquotas de 10 μL das suspensões não diluídas e diluídas em placas de agarose, incubar as placas a 37 °C durante a noite, contar as colónias e calcular o número de bactérias (unidades formadoras de colónias, UFC).

2. Reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra

1. Siga os procedimentos gerais para reprodução, colheita e manutenção de embriões de peixe-zebra, com as modificações descritas abaixo. Cruze uma família de peixe-zebra Tupfel de barbatana longa (TL) do tipo selvagem ou peixe-zebra da linha transgênica selecionada (aqui, Mpeg1: Kaede) em um tanque com uma rede adicionada para induzir as fêmeas adultas a produzir ovos depois que a luz acende e, em seguida, separe os adultos dos ovos produzidos.
2. No dia seguinte, colete os embriões e descarte os não transparentes, que não são viáveis. Manter cerca de 60 embriões por placa de Petri (100 mm de diâmetro) em meio E3 e incubar a 28 °C. Remover os embriões mortos e anormais e refrescar diariamente o meio E3.

3. Preparação de agulhas de injeção

1. Prepare as agulhas microcapilares de vidro para injeção usando um instrumento extrator de micropipeta. Use as seguintes configurações: calor: 772, tração: 100, vel: 200, tempo: 40, gás: 75.
2. Quebre a ponta da agulha com uma pinça na posição em que a agulha tenha um diâmetro externo de aproximadamente 20 μm (para microesferas de 10 μm), usando um microscópio óptico com uma barra de escala na ocular. Evite agulhas com abertura muito grande, pois comprometerão a sobrevivência dos embriões.
   NOTA: A abertura pode ser escolhida para ser menor ou maior, dependendo do tamanho e forma dos biomateriais a serem injetados. Na literatura, injeções usando agulhas com abertura de aproximadamente 50 μm têm sido relatadas como causadoras de uma diminuição significativa na sobrevivência embrionária.

4. Injeção de suspensão de bactérias ou microesferas bacterianas em embriões de peixe-zebra

1. Aqueça a solução de agarose (1–1,5% (peso) em demi-água) usando um forno de micro-ondas e despeje em uma placa de Petri de 100 mm. Coloque um molde de plástico em cima da solução de agarose na placa de Petri para criar reentrâncias na agarose para colocar os embriões em posições adequadas e facilitar as injeções. Incube em temperatura ambiente e remova o molde quando a solução de agarose estiver solidificada.
2. Aos 3 dias após a fertilização, coloque os embriões em uma placa de Petri de 100 mm contendo 0,02% (p / v) de ácido 3-aminobenzóico (Tricaína) para anestesiá-los. Após 5 min, transfira os embriões para a placa de agarose revestida com meio E3 contendo 0,02% (p / v) de tricaína e alinhe-os em uma orientação para injeção. Para o Mpeg1: A linha transgênica Kaede primeiro anestesia embriões em meio E3 contendo 0,02% (p/v) de tricaína. Em seguida, selecione embriões que expressam proteínas fluorescentes verdes usando um microscópio de fluorescência estéreo.
3. Carregue a agulha com aproximadamente 10 μL da suspensão "Somente bactérias" ou Microesferas de bactérias usando uma ponta de pipeta microcarregadora. Monte a agulha em um micromanipulador conectado ao microinjetor. Para o injetor usado aqui (consulte a Tabela de Materiais), use as seguintes configurações para injeções de 2–3 nL: pressão: 300–350, contrapressão: 0, tempo: 2 ms. NOTA: As configurações do microinjetor dependem do injetor usado. As configurações do injetor podem precisar ser ajustadas para injeções de bactérias misturadas com biomateriais com outras formas ou tamanhos.
   1. Use agulhas com a mesma abertura para a injeção da suspensão "Bacteria-only" e da suspensão Bacteria-Microspheres. Se a agulha estiver quebrada ou entupida, sempre troque por uma nova agulha para injeções adicionais.
4. Insira a agulha no tecido muscular dos embriões sob um microscópio óptico (Figura 1), em um ângulo de 45 a 60 ° entre a agulha e o corpo dos embriões. Ajuste a posição da agulha no tecido movendo-a suavemente para frente e para trás. Injete os embriões usando um pedal conectado ao microinjetor.
5. Após a injeção de bactérias fluorescentes, marque os embriões para infecção bem-sucedida em um microscópio de fluorescência estéreo. Descarte os embriões com pontuação negativa (sem bactérias fluorescentes visíveis ou sem microesferas fluorescentes visíveis). Manter os embriões individualmente em meio E3 em placas de 48 poços. Atualize o meio diariamente.

5. Esmagamento de embriões, pontuação microscópica e cultura quantitativa de bactérias

1. Pontue todos os embriões microscopicamente quanto à presença de bactérias fluorescentes usando um microscópio de fluorescência estéreo, começando imediatamente após as injeções e em cada dia subsequente até que os embriões sejam selecionados aleatoriamente para cultura quantitativa.
2. Selecione aleatoriamente alguns embriões vivos infectados (5 a 6 no presente estudo) logo após a injeção e transfira-os individualmente para separar microtubos de 2 mL usando pontas estéreis. Remova o meio, lave os embriões suavemente com PBS estéril uma vez e adicione 100 μL de PBS estéril.
3. Adicione 2 a 3 esferas de zircônia estéreis (2 mm de diâmetro) a cada frasco e esmague os embriões usando o homogeneizador (consulte a Tabela de Materiais) a 3.500 rpm por 30 s. Cultivar quantitativamente o homogeneizado, conforme descrito no passo 1.3.
   NOTA: Outros homogeneizadores podem exigir configurações diferentes.
4. Selecionar aleatoriamente vários embriões nos dias subsequentes após a injeção para cultura quantitativa de acordo com o passo 5.3.

Resultados

Figura 1: Procedimento esquemático de co-injeção da suspensão de Bactérias-Microesferas no músculo caudal de embriões de peixe-zebra.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar soja tríptica	BD Difco	236950	Unidade de preparação de meios na AMC
Caldo de soja tríptico	BD Difco	211825
Polivinilpirrolidona40	Aplicativo	A2259.0250
Microesferas de poliestireno de 10 μm de diâmetro (fluorescente azul)	Tecnologia da vida/ThemoFisher	Rolamento F8829
Vidro microcapilar (1 mm OD x 0,78 mm DI)	Aparelho de Harvard	30-0038
Instrumento extrator de micropipeta	Instrumento Sutter Inc	Flamejante p-97
Microscópio óptico LM 20	Leica	ODM33 10450123
Ácido 3-aminobenzóico (tricaína)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Agarose MP	Roche	11388991001
Microscópio fluorescente estéreo LM80	Leica	MDG3610450126
Ponteiras de pipeta de microcarregador	Eppendorf	5242956.003
Micromanipulador M3301 com suporte M10	Instrumentos de precisão mundiais	00-42-101-0000
Microinjetor expresso FemtoJet	Eppendorf	Rolamento 5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Grânulos de zircônia	Bio-conexão	11079124ZX
Analisador MagNA	Roche	41416401
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Agitador giratório (para crescimento bacteriano)	Científico de New Brunswick	G10
Incubadora de peixe-zebra	VWR	Incu-linha
Cuvetes	MARCA	759015
Centrifuga	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Espectrómetro	Farmacêutica biotecnológica	Ultrospec®2000
Fórceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 placas de poços	Greiner bio-one	677180
96 placas de poços	Greiner bio-one	655161
Placa de Petri	Falcão	353003
Placa de Petri	Biomerieux	NL-132